10月27日，國際學術期刊Advanced Science在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心（生物化學與細胞生物學研究所）代海強研究組聯(lián)合吳薇研究組的研究成果:”HTGTS‐TCR‐Seq for Profiling of Mouse and Human T‐Cell Receptor α and β Gene Rearrangements and Diversity”。該研究基于高通量全基因組易位測序(HTGTS)技術，開發(fā)了新型DNA測序方法HTGTS-TCR-seq，旨在精準解析αβ T細胞受體（TCR）的重排過程。

TCR多樣性是適應性免疫的核心，于T細胞發(fā)育過程中不同時期經(jīng)歷基因組V、D、J片段重排產(chǎn)生。Tcrb重排發(fā)生在DN3階段，通過RAG內(nèi)切酶催化斷裂一個D和一個J基因元件，進而通過非同源重組末端連接（NHEJ）形成DJβ中間產(chǎn)物，再經(jīng)過RAG斷裂和NEHJ連接一個V基因元件，最終形成完整TCRβ。經(jīng)歷β-選擇后，T細胞由DN3發(fā)育至CD4⁺CD8⁺雙陽性(DP)階段，然后發(fā)生Tcra重排，由一個V和一個J基因元件連接形成完整TCRα。傳統(tǒng)TCR檢測方法主要依賴多重PCR和5'RACE等技術，然而mRNA水平的5'cDNA末端快速擴增技術(5’RACE)受轉錄本豐度影響，且無法反映DNA水平的初始重排情況；DNA水平的多重PCR需大量特異性引物，始終存在引物偏倚。

在這項研究中，研究人員基于線性擴增介導的PCR技術(LAM-PCR)，通過對TCR基因片段進行有限數(shù)量的引物設計，靶向TCR基因片段，從而直接捕獲基因組重排事件。該方法從源頭上規(guī)避了引物偏倚，實現(xiàn)在DNA層面可對重組效率、功能性與非功能性TCR重排的檢測分析。利用該體系，研究人員首先對小鼠胸腺細胞不同發(fā)育階段分析，結果顯示，DN3發(fā)育階段非功能性重組頻率較高，陽性選擇前的雙陽性胸腺細胞(preselection DP)功能性重組頻率較高，與理論預期高度吻合；雙陽性胸腺細胞在Tcra重排上呈現(xiàn)出階梯式重排特征，印證了連續(xù)發(fā)生的初級與次級重排事件模型。在年齡相關的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)衰老改變了Vα片段的使用偏好，這一趨勢在胸腺非成熟T細胞和外周成熟T細胞中均一致，提示小鼠中這一增齡性改變源于胸腺輸出環(huán)節(jié)。為了進一步將方法應用推廣至機制研究，研究人員對Wapl基因敲除的陽性選擇前的雙陽性胸腺細胞的研究，發(fā)現(xiàn)黏連蛋白卸載因子WAPL獨立于細胞分裂的作用影響Tcra基因重排。此外，研究人員通過對人源特異性引物設計，將應用推廣至人類外周T細胞樣品上，展現(xiàn)出了臨床轉化應用的潛在價值。

綜上，這項研究建立了新型無偏倚的基因組TCR測序方法，揭示了發(fā)育階段特異性V/J片段使用規(guī)律及增齡性TCR變化，證實了該方法在人類樣本中具有同等應用潛力，有望為T細胞發(fā)育、衰老和免疫相關疾病等研究提供新的視角。

分子細胞卓越中心代海強研究員和吳薇研究員為該論文共同通訊作者，博士研究生羅睿和宋亞偉為共同第一作者。博士研究生王美晨、鄒龍昊、焦芳太和楊天歌在數(shù)據(jù)處理和材料制備等方面也做出了重要貢獻。本研究得到了分子細胞卓越中心王廣川研究員和香港科技大學（廣州）梁卓毅教授的大力支持。項目獲得了國家重點研發(fā)計劃、中國科學院戰(zhàn)略性先導科技專項、上海市基礎研究重大研究計劃、中國科學院國際伙伴計劃、國家自然科學基金、上海市自然科學基金、表觀遺傳調(diào)控與干預全國重點實驗室開放課題、本源公益基金等項目資助。研究工作還得到了本中心公共技術服務中心動物實驗技術平臺、細胞分析技術平臺和分子生物學技術平臺的大力支持。特別感謝多細胞體系結構與功能重點實驗室及沈義棟研究員提供衰老小鼠，感謝分子細胞卓越中心劉小龍研究員和南京大學華子春教授提供T細胞特異性工具鼠。

文章鏈接：https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202509497

HTGTS-TCR-seq技術示意圖