4月3日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊PNAS在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌研究組與香港中文大學(xué)呂愛(ài)蘭研究組的合作研究成果，題為“Dual genetic tracing demonstrates the heterogeneous differentiation and function of neuromesodermal progenitors in vivo”。該研究構(gòu)建了雙同源重組酶系統(tǒng)，成功建立了體內(nèi)神經(jīng)中胚層祖細(xì)胞（Neuromesodermal progenitors, NMPs）的譜系示蹤及功能研究技術(shù)，并結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，深入揭示了NMPs在胚胎發(fā)育中的細(xì)胞命運(yùn)和分子特征。這一研究不僅揭示了NMPs在胚胎發(fā)育中的分布、分化潛能和功能，更為脊髓損傷的細(xì)胞治療提供了新的研究方向。
脊髓作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，承擔(dān)著神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)和肌肉運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)等關(guān)鍵功能。然而，目前針對(duì)脊索退行性病變及外源性脊髓損傷的治療手段仍存在明顯局限。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，NMPs不僅能夠分化為脊髓中的神經(jīng)細(xì)胞，還可以產(chǎn)生周圍的中胚層組織，在脊髓損傷的細(xì)胞治療中具有重要應(yīng)用前景。盡管既往研究已經(jīng)證實(shí)NMPs具有雙向分化潛能，但缺乏在體內(nèi)直接示蹤和功能評(píng)估的遺傳工具。因此，開(kāi)發(fā)精準(zhǔn)靶向體內(nèi)NMPs的技術(shù)對(duì)于揭示其細(xì)胞命運(yùn)和功能至關(guān)重要。
在該項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)和構(gòu)建了多種雙同源重組酶系統(tǒng)，成功建立了哺乳動(dòng)物體內(nèi)特異性標(biāo)記NMPs的遺傳譜系示蹤新技術(shù)。研究發(fā)現(xiàn)，NMPs具有雙向分化潛能，能夠同時(shí)生成神經(jīng)細(xì)胞和中胚層細(xì)胞。此外，通過(guò)特異性清除NMPs的實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)NMPs減少導(dǎo)致胚胎軀干和尾部發(fā)育異常，進(jìn)一步證實(shí)了NMPs在胚胎發(fā)育中的關(guān)鍵作用。相關(guān)研究成果不僅解答了重要的發(fā)育生物學(xué)問(wèn)題而且為脊髓損傷的臨床治療提供了重要的理論基礎(chǔ)和研究思路。
研究團(tuán)隊(duì)首先對(duì)小鼠胚胎期8.5天的尾端組織進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。通過(guò)分析，將細(xì)胞主要分為14個(gè)不同的簇，包括NMPs、Neural tube、Somite和Presomitic mesoderm等。進(jìn)一步深入分析，研究人員發(fā)現(xiàn)NMPs特異性表達(dá)Brachyury（T）和Sox2，同時(shí)高表達(dá)Nkx1-2、Epha5、Fgf17和Fgf8等分子標(biāo)志基因。研究還揭示了NMPs的分化受到Wnt、FGF和BMP等信號(hào)通路的精密調(diào)控：Wnt和FGF信號(hào)通路促進(jìn)NMPs向中胚層分化，而BMP信號(hào)通路則通過(guò)抑制Sox2的表達(dá)推動(dòng)NMPs向中胚層命運(yùn)轉(zhuǎn)變；相反，視黃酸（RA）信號(hào)通路通過(guò)抑制Wnt信號(hào)促進(jìn)NMPs向神經(jīng)命運(yùn)分化。
為精準(zhǔn)示蹤NMPs，研究人員利用Dre-rox和Cre-loxP兩套同源重組系統(tǒng)，分別構(gòu)建了T-DreER和Sox2-CreER基因敲入遺傳工具小鼠，來(lái)分別標(biāo)記T來(lái)源和Sox2來(lái)源的細(xì)胞。研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了兩套遺傳策略來(lái)特異性標(biāo)記示蹤體內(nèi)NMPs。在第一套策略中，研究人員使用Rosa26-traffic light reporter（Rosa26-CAG-rox-Stop-rox-ZsGreen-insulator-CAG-loxP-Stop-loxP-tdTomato，R26-TLR）系統(tǒng)。通過(guò)Tamoxifen誘導(dǎo)，可以在T-DreER;Sox2-CreER;R26-TLR小鼠體內(nèi)同時(shí)分別標(biāo)記T+細(xì)胞（ZsG+，綠色熒光）、Sox2+細(xì)胞（tdT+，紅色熒光）以及T+Sox2+雙陽(yáng)性細(xì)胞（ZsG+tdT+，呈現(xiàn)黃色熒光）。這一方法成功實(shí)現(xiàn)了在單個(gè)胚胎中同時(shí)追蹤T+、Sox2+和T+Sox2+三群細(xì)胞。為了更加清晰直觀的標(biāo)記NMPs，探究NMPs的細(xì)胞定位、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和分化的細(xì)胞類型，研究人員開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)了第二套策略，R26-RL-GFP(Rosa26 rox-Stop-rox-loxP-Stop-loxP-eGFP)系統(tǒng)。在T-DreER;Sox2-CreER;R26-RL-GFP三基因小鼠中，只有Dre-rox和Cre-loxP雙重重組的情況下才會(huì)激活GFP表達(dá)，從而特異性地標(biāo)記T+Sox2+的NMPs。通過(guò)這兩套雙重組酶介導(dǎo)的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，研究人員成功追蹤了NMPs在胚胎發(fā)育過(guò)程中的時(shí)空分布，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞主要定位于胚胎的尾部區(qū)域，參與神經(jīng)管、軸旁中胚層以及部分內(nèi)胚層組織的形成。
為了探究單個(gè)NMP是否具有雙向分化潛能，研究團(tuán)隊(duì)利用R26-confetti2報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行單細(xì)胞克隆分析。通過(guò)低劑量Tamoxifen誘導(dǎo)，研究人員在E8.5成功標(biāo)記了單個(gè)NMP。進(jìn)一步結(jié)果顯示，單個(gè)NMP能夠分化為神經(jīng)細(xì)胞克隆、中胚層細(xì)胞克隆或同時(shí)生成兩種細(xì)胞類型的混合克隆。這一發(fā)現(xiàn)直接證實(shí)了NMPs在體內(nèi)的雙向分化潛能。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)少數(shù)NMPs還能夠分化為內(nèi)胚層細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了NMPs在胚胎發(fā)育中的已知貢獻(xiàn)，揭示了其在多胚層組織形成中的潛在作用。
接下來(lái)為了進(jìn)一步闡明NMPs在胚胎發(fā)育中的功能，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了T-DreER;Sox2-CreER;R26-LR-DTR小鼠模型，通過(guò)雙重組酶介導(dǎo)白喉毒素受體（DTR）的表達(dá)，從而特異性清除NMPs。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NMPs的清除會(huì)導(dǎo)致胚胎軀干和尾部發(fā)育嚴(yán)重異常，表現(xiàn)為尾部縮短和軀干結(jié)構(gòu)畸形。這一結(jié)果直接證明了NMPs在胚胎發(fā)育中的關(guān)鍵作用。研究還發(fā)現(xiàn)，NMPs的清除時(shí)間點(diǎn)對(duì)其功能影響顯著。E8.5清除NMPs僅導(dǎo)致輕微的尾部發(fā)育缺陷，而E10.5清除則會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的軀干和尾部發(fā)育異常，這一現(xiàn)象可能與胚胎發(fā)育過(guò)程中其他細(xì)胞群體的代償作用有關(guān)。
綜上，這項(xiàng)研究通過(guò)開(kāi)發(fā)新型遺傳工具，首次在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)NMPs的特異性遺傳標(biāo)記、示蹤和功能評(píng)估。研究不僅深化了對(duì)NMPs在胚胎發(fā)育中作用機(jī)制的理解，為疾病建模、藥物研發(fā)以及細(xì)胞治療等領(lǐng)域的發(fā)展奠定了重要基礎(chǔ)，更為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了新的研究方向，具有重要的科學(xué)意義和潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。
分子細(xì)胞卓越中心周斌研究組副研究員金恒薇和博士生劉子鑫為該論文共同第一作者。分子細(xì)胞卓越中心周斌研究員和香港中文大學(xué)呂愛(ài)蘭教授為該論文共同通訊作者。該研究得到南模生物、國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（上海），以及分子細(xì)胞卓越中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)、細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)和分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)的大力支持和幫助。該工作得到中國(guó)科學(xué)院、基金委、科技部、上海市科委、香港研資局、新基石科學(xué)基金會(huì)等支持。
示蹤的NMPs在胚胎E8.5和E10.5的時(shí)空分布
