1月21日，國際學(xué)術(shù)期刊Cell Discovery在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心(生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所)李勁松研究組和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院李文團隊的最新研究成果: “Generation of live mice from haploid ESCs with germline-DMR deletions or switch”。研究人員建立了融合低甲基化的孤雄和孤雌單倍體胚胎干細胞研究印記調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的體外模擬系統(tǒng)（Ha-Ha融合系統(tǒng)），通過刪除10個印記DMR來重建印記調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，顯著提高融合胚胎干細胞的發(fā)育潛能，有效支持四倍體補償小鼠的足月發(fā)育。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)印記對于發(fā)育的調(diào)節(jié)功能并不受其遺傳親源性別的限制。

基因組印記是一種由DNA甲基化介導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控過程，通過配子傳遞至受精卵，在哺乳動物發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。印記基因普遍成簇存在，受到差異甲基化區(qū)域（DMR）的調(diào)節(jié)，呈現(xiàn)單等位基因表達的特點。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，DMR刪除能在很大程度上模擬其高甲基化調(diào)控狀態(tài)，因而這種方式經(jīng)常被用來研究印記區(qū)域的基因表達調(diào)控和發(fā)育學(xué)功能。盡管既往研究表明多個印記區(qū)域在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但因缺少操控多個印記區(qū)域互作的在體研究工具，發(fā)育相關(guān)的印記調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未得到系統(tǒng)闡述。

單倍體胚胎干細胞（haESCs）作為小鼠遺傳學(xué)研究的有力工具，在實現(xiàn)單親生殖中發(fā)揮重要作用。在將甲基化缺失的孤雌haESCs的H19-DMR和IG-DMR刪除后，其可以替代精子，高效地支持孤雌生殖小鼠的發(fā)育。而無甲基化修飾的孤雄haESCs在進行7個母源印記DMR刪除后，也可以作為卵子遺傳物質(zhì)的替代物支持孤雄胚胎的足月發(fā)育。因此，利用haESC攜帶的DNA替代精子和卵母細胞的遺傳物質(zhì)可以作為研究印記調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的新思路。

為了研究發(fā)育過程中的印記調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究人員建立了一套操控父母源印記狀態(tài)的研究系統(tǒng)。首先，研究人員在印記修飾缺失的孤雄和孤雌haESCs中分別刪除父源和母源DMR，用以模擬父源和母源的印記狀態(tài)。然后，通過細胞融合的方式獲得重建印記調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的二倍體細胞。最后，通過四倍體補償實驗對二倍體細胞的發(fā)育潛能進行體內(nèi)驗證，進而系統(tǒng)性地分析被刪除DMR在小鼠發(fā)育過程中的作用（圖一）。利用這套系統(tǒng)，研究人員發(fā)現(xiàn)母源印記缺失的二倍體細胞只能使四倍體補償胚胎發(fā)育至胚胎期9.5天。而經(jīng)過多輪的篩選后發(fā)現(xiàn)，父源印記的H19-DMR和IG-DMR，與母源印記的Xist-DMR，Igf2r-DMR，Kcnq1-DMR，Gnas-DMR，Peg3-DMR，Nespas-DMR，Snrpn-DMR和Grb10-DMR的聯(lián)合刪除可以促進小鼠的足月發(fā)育，其中一只小鼠存活至23天（圖二，a）。這個結(jié)果表明小鼠發(fā)育過程中需要復(fù)雜的印記網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，其中上述10個區(qū)域在胚胎發(fā)育階段和新生兒發(fā)育階段發(fā)揮重要作用。

此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)DMR刪除的遺傳親源模式同樣可以有效地調(diào)節(jié)小鼠發(fā)育。在Ha-Ha融合系統(tǒng)中，將母源印記的Snrpn-DMR進行父源刪除，可以參加四倍體補償胚胎完成足月發(fā)育（圖二，b）。而將H19-DMR印記修飾缺失的孤雄單倍體細胞注射進H19-DMR刪除的卵子中時，也可以獲得健康發(fā)育的小鼠（圖二，c）。這個結(jié)果表明印記調(diào)控模式的主要功能在于調(diào)節(jié)印記基因的表達劑量，而這種功能的實現(xiàn)并不受其遺傳親源性別的限制。這個結(jié)論與印記“沖突”理論的基本假設(shè)相符，對于印記“沖突”理論有支持作用。

綜上，本文通過Ha-Ha融合系統(tǒng)對多個印記調(diào)控區(qū)域進行遺傳操控，證明了由H19-DMR，IG-DMR，Xist-DMR，Igf2r-DMR，Kcnq1-DMR，Gnas-DMR，Peg3-DMR，Nespas-DMR，Snrpn-DMR和Grb10-DMR組成的印記調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對于小鼠發(fā)育的重要意義。同時，也證明了印記調(diào)控模式并不受遺傳親源性別的限制。

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院馬永健博士和分子細胞卓越中心晏萌博士為該文共同第一作者。分子細胞卓越中心李勁松研究員和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院李文教授為該論文的共同通訊作者。感謝分子細胞卓越中心徐國良研究員、李黨生研究員、劉默芳研究員和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院章美玲副教授對本研究的指導(dǎo)和幫助。該項研究得到了基因組標簽計劃、國家自然科學(xué)基金、國家重點研發(fā)計劃、上海市科學(xué)技術(shù)重大專項和上海市科學(xué)技術(shù)委員會基礎(chǔ)研究重大專項的資助，以及分子細胞卓越中心分子生物學(xué)技術(shù)平臺、細胞分析技術(shù)平臺、化學(xué)生物學(xué)技術(shù)平臺和動物實驗技術(shù)平臺的幫助與支持。

文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41421-024-00757-x

圖一，Ha-Ha融合系統(tǒng)的建立及其在發(fā)育中印記調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究中的應(yīng)用

圖二，小鼠發(fā)育過程中的核心印記調(diào)控網(wǎng)絡(luò)