北京時(shí)間5月20日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Cell Stem Cell在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）惠利健研究組聯(lián)合仁濟(jì)醫(yī)院夏強(qiáng)院士團(tuán)隊(duì)、華東師范大學(xué)李大力研究員團(tuán)隊(duì)和上海科技大學(xué)iHuman研究所鐘桂生研究員團(tuán)隊(duì)的最新合作研究成果：“Efficient expansion and CRISPR-Cas9-mediated gene correction of patient-derived hepatocytes for treatment of inherited liver diseases”。該項(xiàng)研究在前期工作的基礎(chǔ)上建立了高效的肝臟遺傳代謝性病人來(lái)源的肝細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)，并且實(shí)現(xiàn)了多種病人來(lái)源肝細(xì)胞的體外長(zhǎng)期大量擴(kuò)增。在此基礎(chǔ)上，研究人員優(yōu)化和建立了CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因敲入技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了在遺傳代謝性疾病病人來(lái)源的增殖肝細(xì)胞中高效定點(diǎn)糾正病人缺陷基因。此外，基因編輯的增殖肝細(xì)胞移植可以高效整合、再殖小鼠肝臟，并成功治療了酪氨酸血癥小鼠模型，證明體外基因糾正的增殖肝細(xì)胞治療的有效性。綜上，該研究建立了一套高效的肝臟遺傳代謝性疾病病人來(lái)源肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)和基因編輯技術(shù)，為人類肝臟遺傳代謝性疾病的自體肝細(xì)胞治療提供了概念上的驗(yàn)證。
肝臟作為人體新陳代謝的中心器官，其中肝細(xì)胞是肝臟功能最主要的承擔(dān)者。肝細(xì)胞中一些關(guān)鍵功能基因的突變會(huì)導(dǎo)致危及生命的肝臟遺傳代謝性疾病的發(fā)生，這類疾病的致病基因較多并且病情嚴(yán)重，目前除肝移植外尚無(wú)有效的治療方式。然而，肝細(xì)胞在移植后具有很強(qiáng)的肝臟再殖能力，一些患有肝臟遺傳性疾病的動(dòng)物模型通過(guò)肝細(xì)胞移植后得到了有效的治愈。因此，肝細(xì)胞移植（Hepatocyte Transplantation, HTx）作為一種替代肝器官移植治療肝臟遺傳代謝性疾病的治療方式具有廣闊的應(yīng)用前景。但是前期大量基礎(chǔ)和臨床研究結(jié)果表明，異體肝細(xì)胞治療的長(zhǎng)期有效性受限于移植后細(xì)胞的免疫排斥。所以，有效避免移植后細(xì)胞的免疫清除是實(shí)現(xiàn)病人肝細(xì)胞治療成功的核心難題。
惠利健團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期致力于研究開(kāi)發(fā)新型肝細(xì)胞來(lái)源和終末期肝臟疾病治療的相關(guān)研究。2018年，該團(tuán)隊(duì)建立了人原代肝細(xì)胞（Primary Human Hepatocyte, PHH）大規(guī)模擴(kuò)增體系，在體外將PHH去分化為可增殖的人肝細(xì)胞(Proliferating Human Hepatocytes, ProliHHs)，該細(xì)胞介于肝細(xì)胞和前體細(xì)胞的雙表型狀態(tài)，能夠在體外培養(yǎng)擴(kuò)增超過(guò)10000倍，滿足臨床肝細(xì)胞移植所需細(xì)胞量。將該細(xì)胞移植到肝臟酪氨酸血癥模型Fah-/-Rag2-/-IL2rg-/-（FRG）小鼠時(shí)，擴(kuò)增的ProliHHs重建肝實(shí)質(zhì)的效果能達(dá)到非常高的水平，這使其成為極有前景的細(xì)胞來(lái)源用于肝細(xì)胞治療。2024年3月，該團(tuán)隊(duì)實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模制備海藻酸鈉微膠囊包裹的ProliHHs類器官，并用于肝衰竭治療，為正在進(jìn)行的臨床研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
為了探究肝臟遺傳性疾病患者來(lái)源肝細(xì)胞的體外擴(kuò)增及基因修復(fù)后的回輸治療，研究人員首先著手于分離和培養(yǎng)這些肝臟遺傳性疾病患者來(lái)源的PHH。經(jīng)研究，他們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)優(yōu)化的培養(yǎng)基EHM（Enhanced Hepatocyte Medium），能夠促使來(lái)自10種不同疾病基因突變所導(dǎo)致的遺傳代謝性疾病患者來(lái)源的肝細(xì)胞在體外迅速增殖，并且同一疾病的多個(gè)患者表現(xiàn)出相似的培養(yǎng)結(jié)果。經(jīng)過(guò)連續(xù)的細(xì)胞傳代擴(kuò)增，從1克肝組織中分離的肝細(xì)胞（5x106）理論上可以擴(kuò)增至1000倍，最終可達(dá)到5x109數(shù)量級(jí)的擴(kuò)增肝細(xì)胞，為后續(xù)治療提供了充足的細(xì)胞來(lái)源。
隨后，研究人員采用在ProliHHs基因組中定點(diǎn)基因敲入的治療策略來(lái)糾正患者的基因缺陷。為了更貼近當(dāng)前基因編輯細(xì)胞的臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，他們采用電轉(zhuǎn)的方法將Cas9-sgRNA蛋白復(fù)合體（RNPs）和外源基因片段（Donor）遞送至ProliHHs，以進(jìn)行基因定點(diǎn)敲入表達(dá)。通過(guò)優(yōu)化ProliHHs細(xì)胞的電轉(zhuǎn)程序、Donor的定向整合策略和AAV亞型篩選，研究人員實(shí)現(xiàn)了顯著高水平的敲入效率（24%-66%）。同時(shí)，經(jīng)過(guò)基因編輯的細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞保持相對(duì)穩(wěn)定編輯效率。此外，研究人員還嘗試富集基因編輯后的ProliHHs，并對(duì)其功能蛋白的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。最后，為驗(yàn)證編輯后患者細(xì)胞的治療效果，研究人員培養(yǎng)了酪氨酸血癥患者來(lái)源的肝細(xì)胞，并通過(guò)基因敲入方式糾正了患者缺陷的FAH基因。移植后，基因編輯后的ProliHHs成功地整合到FRG小鼠肝臟中，實(shí)現(xiàn)了小鼠模型的治療效果。
分子細(xì)胞卓越中心張坤博士、仁濟(jì)醫(yī)院萬(wàn)平主治醫(yī)生和華東師范大學(xué)王立人副研究員為該論文的共同第一作者。分子細(xì)胞卓越中心惠利健研究員、仁濟(jì)醫(yī)院夏強(qiáng)院士、華東師范大學(xué)李大力研究員、上?？萍即髮W(xué)iHuman研究所鐘桂生研究員和分子細(xì)胞卓越中心張坤博士為該論文的共同通訊作者。該項(xiàng)工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、上海市科委、科技部、中國(guó)科學(xué)院等項(xiàng)目的資助，以及分子細(xì)胞卓越中心分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)、細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)、化學(xué)生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)的幫助與支持。
文章鏈接：?https://doi.org/10.1016/j.stem.2024.04.022
基因編輯糾正病人來(lái)源可增殖人肝細(xì)胞實(shí)現(xiàn)遺傳代謝性肝臟疾病治療
