4月13日，國際學(xué)術(shù)期刊Nucleic Acids Research在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周小龍研究組最新研究成果“Activity reconstitution of Kre33 and Tan1 reveals a molecular ruler mechanism in eukaryotic tRNA acetylation”。該項工作首次成功重組真核生物細(xì)胞質(zhì)tRNA乙酰化修飾活力，揭示乙?；揎椕笍?fù)合物Kre33-Tan1對底物的專一性識別機制，實現(xiàn)tRNA及小RNA分子上的定點高效乙?；揎?。
在細(xì)胞內(nèi)所有RNA分子中，tRNA含有最為密集且種類最為多樣的轉(zhuǎn)錄后修飾。目前，主要發(fā)現(xiàn)2種RNA乙酰化修飾種類，即N4-乙酰胞苷(ac4C)及N6-乙酰腺苷(ac6A)。ac4C在三界生物以及病毒來源的多種RNA (包括tRNA、mRNA、rRNA)中均廣泛存在，而ac6A只存在于古細(xì)菌來源的tRNA中。
上世紀(jì)60年代，ac4C首先在真核生物的tRNASer和tRNALeu以及細(xì)菌延伸tRNAMet (tRNAMet(e))被鑒定。在細(xì)菌tRNA中，ac4C特異性地存在于tRNAMet(e)反密碼子第一位(第34位, ac4C34)。ac4C34活力重組、結(jié)構(gòu)解析以及遺傳學(xué)數(shù)據(jù)表明，TmcA以及TmcAL蛋白質(zhì)通過兩種不同的機制，分別利用乙酰輔酶A或乙酸作為乙酰供體，催化tRNAMet(e) ac4C34的生物合成。ac4C34可以阻止tRNAMet(e)的CAU反密碼子與異亮氨酸AUA密碼子的配對，防止AUA密碼子被解碼為甲硫氨酸，從而確保了細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的精確性。
就真核生物tRNA而言，ac4C專一性地存在于第12位(ac4C12)。雖然發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)60年代，直到2004年，Tan1被發(fā)現(xiàn)參與ac4C12形成，但Tan1沒有催化活性中心，普遍認(rèn)為是一個RNA結(jié)合蛋白質(zhì)。2015年，真核生物tRNA ac4C12修飾酶Kre33才被鑒定。Kre33主要定位于核仁，是rRNA前體加工成熟的輔助因子。近年來，人THUMPD1 (Tan1同源蛋白質(zhì))系列點突變導(dǎo)致出生缺陷型神經(jīng)發(fā)育異常。但長期以來，真核生物tRNA ac4C12修飾從未被成功重組，導(dǎo)致ac4C12生物合成的分子基礎(chǔ)、底物識別機制、相關(guān)疾病的分子機制等完全未知，也無法基于修飾機器在特定RNA分子上實現(xiàn)定點乙?；揎棥?/span>
在該項研究中，研究人員通過分析核糖體亞基前體剪接復(fù)合體中的Kre33結(jié)構(gòu)，并結(jié)合AlphaFold預(yù)測的Tan1結(jié)構(gòu)，合理設(shè)計表達(dá)質(zhì)粒，獲得高純度的Kre33與Tan1蛋白質(zhì)；通過條件優(yōu)化，利用乙酰輔酶A作為乙?；w，實現(xiàn)tRNASer以及tRNALeu上的高效乙?；揎?；系統(tǒng)研究了Kre33-Tan1識別tRNA底物的識別機制，提出了真核生物tRNA乙?；揎椀摹胺肿訕?biāo)尺”模型；在特定tRNA底物上實現(xiàn)100%乙?；揎椥剩崿F(xiàn)了多種非乙?；?/span>tRNA底物變體的高效乙?；揎棧换凇胺肿訕?biāo)尺”模型，實現(xiàn)小RNA的位點特異性高效乙酰化修飾；進一步通過制備乙?；揎椀?/span>tRNASer以及tRNALeu，揭示乙?；揎棇τ?/span>tRNA的熱動力學(xué)以及氨基酰化水平?jīng)]有顯著影響，可能在翻譯延伸的轉(zhuǎn)位過程中介導(dǎo)了tRNA與核糖體的相互作用。
該研究首次成功重組真核生物tRNA乙?；揎椈盍Σ⑻岢隽艘阴；揎椕笍?fù)合物Kre33-Tan1識別底物的“分子標(biāo)尺”模型，實現(xiàn)tRNA與小RNA分子上的定點高效乙?；揎?。以上結(jié)果加深了對真核生物tRNA乙酰化修飾的分子機制的認(rèn)識，并開發(fā)了特定RNA分子定點乙?；揎椆ぞ?，有助于進一步研究RNA乙酰化修飾的機制與生物學(xué)功能，包括鑒定潛在的乙酰化修飾的閱讀器和擦除器。
分子細(xì)胞卓越中心博士研究生馬春蕊為論文第一作者，分子細(xì)胞卓越中心/國科大杭州高等研究院周小龍研究員為論文通訊作者。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院許泓教授團隊參與研究。感謝分子細(xì)胞卓越中心分子生物學(xué)技術(shù)平臺李竑博士大力支持。該研究獲科技部、國家自然科學(xué)基金委、中國科學(xué)院、上海市科委的經(jīng)費資助。
文章鏈接：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkae262/7645239
真核生物tRNA乙?；揎椀膶崿F(xiàn)與機制
