8月29日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Nature Communications在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心(生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)吳立剛研究組與南京醫(yī)科大學(xué)李建民研究組合作的最新研究成果“The non-redundant functions of PIWI family proteins in gametogenesis in golden hamsters”。該研究以金黃地鼠(Mesocricetus auratus，golden hamster)為動(dòng)物模型，全面揭示了PIWI家族成員及其結(jié)合的piRNA在配子發(fā)生和早期胚胎發(fā)生中非冗余的調(diào)控功能，為研究哺乳動(dòng)物piRNA功能奠定了重要基礎(chǔ)。

　　piRNA(PIWI-interacting RNA)是一類生殖細(xì)胞特異表達(dá)的非編碼小RNA，與PIWI蛋白形成效應(yīng)復(fù)合體，參與轉(zhuǎn)座子沉默和基因表達(dá)調(diào)控，在配子發(fā)生和受精卵發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮廣泛而重要的功能。以往對(duì)哺乳動(dòng)物PIWI/piRNA的功能認(rèn)識(shí)主要基于小鼠模型。然而，研究組前期研究表明小鼠卵細(xì)胞中非編碼小RNA的組成在哺乳動(dòng)物中不具有廣泛代表性，并首次在人和食蟹猴卵細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)新的piRNA家族成員os-piRNA(2019，Nature communication)。近期包括該研究組在內(nèi)的三項(xiàng)獨(dú)立研究表明，piRNA通路重要作用蛋白PIWIL1和MOV10L1(RNA解旋酶)的缺失均可導(dǎo)致金黃地鼠雌雄不育，與小鼠中表型有著明顯的差別(2021，Nature Cell Biology)。以上研究證明了小鼠并不是研究哺乳動(dòng)物雌性生殖細(xì)胞發(fā)育中piRNA功能的最佳動(dòng)物模型，以往通過(guò)小鼠建立的哺乳動(dòng)物piRNA經(jīng)典結(jié)論需要在更加具有代表性的金黃地鼠中重新研究或加以確認(rèn)。

　　針對(duì)上述科學(xué)問(wèn)題，研究人員分別制備和獲得了四種PIWI蛋白的特異性抗體，結(jié)合超分辨共聚焦顯微技術(shù)，全面分析了四種PIWI亞家族蛋白在金黃地鼠精子發(fā)生、卵子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)特征，同時(shí)結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)細(xì)致地描繪了不同發(fā)育時(shí)期中PIWI蛋白所結(jié)合的piRNA表達(dá)譜。隨后，研究人員利用CRISPR技術(shù)分別構(gòu)建了四種PIWI缺失的金黃地鼠突變系，研究了不同PIWI蛋白突變所引發(fā)的生殖缺陷表型。結(jié)果表明，PIWIL1同時(shí)在雌性和雄性生殖細(xì)胞及早期胚胎中高表達(dá)，主要結(jié)合29-30 nt piRNA，突變后導(dǎo)致雌雄均不可育：突變的生精細(xì)胞在進(jìn)入雙線期前發(fā)生大量死亡，部分可進(jìn)入雙線期的生精細(xì)胞隨后發(fā)育停滯，而突變的卵母細(xì)胞可正常發(fā)育，但受精后胚胎發(fā)育停滯于2細(xì)胞時(shí)期。PIWIL2和PIWIL4主要在生精細(xì)胞中表達(dá)，但兩者表達(dá)存在明顯的時(shí)期特異性，且分別結(jié)合27 nt或28 nt piRNA。PIWIL2或PIWIL4突變后生精過(guò)程嚴(yán)重受阻，大量精原細(xì)胞凋亡，造成雄性不育。PIWIL3高表達(dá)于卵母細(xì)胞和早期胚胎中，結(jié)合19 nt的os-piRNA，突變后卵母細(xì)胞發(fā)育正常，但受精后的胚胎發(fā)育遲緩，且大部分在發(fā)育過(guò)程中停滯或凋亡，最終導(dǎo)致生育能力顯著下降。

　　研究發(fā)現(xiàn)PIWI蛋白功能存在明確的分工但又緊密聯(lián)系。在卵母細(xì)胞發(fā)育中，PIWIL1/piRNA可以代償PIWIL3/piRNA活性，抑制以LINE/L1和LTR/ERVK為主的活躍轉(zhuǎn)座子的表達(dá)，反之則不然。而在生精細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中，PIWIL4入核功能及其相關(guān)piRNA的加工依賴于PIWIL2，兩者協(xié)同完成轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平沉默。

　　綜上，本研究使用更具代表性的金黃地鼠作為模型，全面繪制了PIWI家族各個(gè)成員在配子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)譜，構(gòu)建并比較了四種PIWI突變體的生育表型和分子表型，發(fā)現(xiàn)四種PIWI蛋白在配子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育中具有非冗余的調(diào)控作用，為piRNA通路異常與人類生殖相關(guān)疾病的診治提供了重要理論基礎(chǔ)和動(dòng)物模型。

　　分子細(xì)胞卓越中心吳立剛研究員和南京醫(yī)科大學(xué)李建民教授及施愛(ài)民教授為該論文的共同通訊作者，分子細(xì)胞卓越中心博士后呂小龍、博士肖穩(wěn)和博士后張宏道、南京醫(yī)科大學(xué)賴婭娜和碩士張肇真為該論文的共同第一作者。該研究得到分子細(xì)胞卓越中心劉默芳研究員和童明漢研究員、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)平臺(tái)以及信息化管理團(tuán)隊(duì)的大力支持。感謝國(guó)家自然科學(xué)基金委、科技部、中國(guó)科學(xué)院、上海市和江蘇省的經(jīng)費(fèi)支持。

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PIWI蛋白表達(dá)及突變后表型示意圖