5月22日, 國際學(xué)術(shù)期刊Nature Communications在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心(生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)李勁松研究組與吳立剛研究組、徐國良研究組和北京大學(xué)湯富酬研究組的合作論文“Base editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation”。該研究建立了一種小鼠受精卵中基于高效胞嘧啶堿基編輯器(cytosine base editor, CBE)的多基因同時敲除系統(tǒng)(inactivation of multiple genes in zygotes, IMGZ)，并通過利用IMGZ系統(tǒng)構(gòu)建Tet/Dnmt家族基因多種組合敲除的胚胎，探討早期胚胎發(fā)育中甲基化和去甲基化的作用，發(fā)現(xiàn)DNMT家族蛋白介導(dǎo)的DNA甲基化在小鼠原腸運(yùn)動中發(fā)揮著重要作用，且不依賴于TET蛋白介導(dǎo)的DNA去甲基化的功能;進(jìn)一步揭示Dnmt缺失胚胎中部分miRNAs啟動子區(qū)域甲基化的完全缺失導(dǎo)致miRNAs的表達(dá)劑量上調(diào)，部分參與導(dǎo)致了小鼠原腸運(yùn)動的失敗。

　　在小鼠早期胚胎的發(fā)育過程中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白DNMT1/3A/3B和雙加氧酶家族蛋白TET1/2/3，動態(tài)調(diào)控DNA胞嘧啶的第五個碳原子上的甲基化(5mC)。受精后，精子和卵子中攜帶的配子源的5mC，會通過DNA復(fù)制介導(dǎo)的被動去甲基化和TET蛋白介導(dǎo)的主動去甲基化而逐漸被擦除，直到囊胚階段達(dá)到最低點(diǎn)。著床后，在DNMT3A和DNMT3B介導(dǎo)的重頭甲基化的作用下，胚胎在原腸運(yùn)動時期DNA甲基化達(dá)到成年的水平，而后DNMT1維持DNA甲基化的功能使其在細(xì)胞分裂的過程中，維持著高度DNA甲基化的狀態(tài)。已有研究表明，配子源敲除TET家族蛋白(TET1/2/3)會導(dǎo)致小鼠原腸運(yùn)動發(fā)生失敗;而攜帶Dnmt1或Dnmt3a/3b突變體的小鼠胚胎，在發(fā)育中期(E9.5)會發(fā)生胚胎致死現(xiàn)象。然而，盡管已經(jīng)產(chǎn)生了缺乏DNA甲基化(Dnmt-null)的小鼠胚胎干細(xì)胞和滋養(yǎng)層干細(xì)胞系，并且它們展示出正常的自我更新的能力，但是DNA甲基化完全缺失的胚胎一直沒有被構(gòu)建，導(dǎo)致其在早期胚胎發(fā)育的功能和機(jī)制一直未被闡釋。

　　為了克服生殖細(xì)胞中條件性敲除多個基因的多重困難，李勁松組建立了合子時期多個基因同時高效敲除的IMGZ系統(tǒng)。他們前期研究成果發(fā)現(xiàn)，胞嘧啶堿基編輯器(CBE)在小鼠受精卵中只需改變單個或兩個堿基，可以特異地實現(xiàn)基因的密碼子由CAA, CAG, CGA或TGG突變成終止密碼子TAA, TAG, TGA或TAA，且對基因組的完整性產(chǎn)生較小的影響。為了實現(xiàn)在合子胚胎中高效的雙等位基因突變，他們在受精卵中比較了6個已報道的CBE系統(tǒng)(BE3, Gam-BE4, hA3A-BE3-Y130F, hA3A-eBE3-Y130F, X-BE3 和 X-BE4)靶向EGFP和Crygc基因后產(chǎn)生終止密碼子的能力，發(fā)現(xiàn)hA3A-eBE3-Y130F可以非常高效地產(chǎn)生單個基因的純合敲除胚胎(>90%)，且在胚胎中只產(chǎn)生了一些低頻的隨機(jī)的SNVs脫靶現(xiàn)象。由于sgRNA的序列和靶向位置，會影響CBE最終的編輯效率，因此選擇高效的sgRNA將會極大促進(jìn)獲得多基因純合敲除胚胎的概率。因此，研究人員開發(fā)了一個快速設(shè)計適合CBE系統(tǒng)的sgRNA的網(wǎng)站(Base-Editor，https://github.com/DiabloRex/BASE-Editor)，根據(jù)預(yù)測選擇靶向單個基因的多條高效的候選sgRNAs。他們首先針對Tet1，Tet2和Tet3基因，分別設(shè)計了3條符合條件會導(dǎo)致TET功能缺失的候選sgRNAs，并通過胚胎中效率測定，確定一條幾乎會100%產(chǎn)生純合敲除胚胎的sgRNA，進(jìn)一步將靶向Tet1/2/3的3條sgRNAs和CBE的mRNA同時注射，高效地一步獲取了Tet-TKO的胚胎。表型分析發(fā)現(xiàn)，合子期敲除TET家族蛋白的胚胎，可以進(jìn)行原腸運(yùn)動，在發(fā)育中期(E10.5)發(fā)生胚胎致死現(xiàn)象。這一結(jié)果顯示卵母細(xì)胞中存在的TET蛋白對于原腸運(yùn)動至關(guān)重要。

　　進(jìn)一步，研究人員利用IMGZ系統(tǒng)獲得了Dnmt1-KO，Dnmt3a/3b-DKO和Dnmt-null的胚胎，表型分析發(fā)現(xiàn)，Dnmt-null的胚胎在原腸運(yùn)動時期形態(tài)明顯異常，未形成完整的原條結(jié)構(gòu)，且無法分化形成大腦、心臟和體節(jié)等原腸運(yùn)動后期結(jié)構(gòu)。而Dnmt1-KO和Dnmt3a/3b-DKO的胚胎卻能正常進(jìn)行原腸運(yùn)動，形成可識別的腦、心臟和體節(jié)等結(jié)構(gòu)，暗示DNMT1和DNMT3A/3B存在一套共同的機(jī)制用于維持DNA甲基化，就可以實現(xiàn)小鼠原腸運(yùn)動的發(fā)生。RNA-seq結(jié)果也顯示Dnmt-null的胚胎相比Dnmt1-KO和Dnmt3a/3b-DKO的胚胎，出現(xiàn)較多的發(fā)育和原腸運(yùn)動相關(guān)通路基因的下調(diào)，而正常DNA甲基化的缺失應(yīng)該會導(dǎo)致基因的上調(diào)，暗示其中可能具有其他的調(diào)控因素。為了探究TET蛋白介導(dǎo)DNA去甲基化在DNMT介導(dǎo)的DNA甲基化調(diào)控胚胎發(fā)育過程的作用，研究人員進(jìn)一步構(gòu)建了Tet/Dnmt1-4KO，Tet/Dnmt3a/3b-5KO和Tet/Dnmt-6KO的胚胎，但是它們發(fā)育的形態(tài)，基因組甲基化的程度和分布模式，與沒有Tet敲除時的Dnmt1-KO，Dnmt3a/3b-DKO和Dnmt-null的胚胎基本一致，說明DNMT蛋白對胚胎發(fā)育的調(diào)控是不依賴于TET家族蛋白的。

　　為了探究Dnmt-null影響胚胎原腸運(yùn)動發(fā)生的分子機(jī)制，研究人員收集不同突變體胚胎E6.5和E7.5的胚外(extraembryonic ectoderm, Exe)和上胚層(epiblast, Epi)組織分別進(jìn)行全基因組甲基化和轉(zhuǎn)錄組測序。比較分析顯示Dnmt1-KO和Dnmt3a/3b-DKO胚胎相比于Dnmt-null胚胎中共同保留的高甲基化位點(diǎn)遍布基因組上的所有位置，包括retrotransposon，enhancer和promoter區(qū)域，且Epi中的位點(diǎn)數(shù)目明顯高于Exe。通過分析這些在retrotransposon和enhancer的高甲基化區(qū)域?qū)ο掠位蜣D(zhuǎn)錄的影響，發(fā)現(xiàn)在Dnmt-null的胚胎相關(guān)基因的表達(dá)并未受這些區(qū)域甲基化的丟失而產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。進(jìn)一步，他們分析保留的高甲基化啟動子區(qū)域?qū)τ诨虮磉_(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)相關(guān)編碼基因基本也不受甲基化的完全丟失而變化，而其中大量的miRNAs啟動子區(qū)域的高甲基化引起了研究人員的關(guān)注。

　　隨后，研究人員利用微量小RNA測序系統(tǒng)(Cas9-assisted small RNA-sequencing, CAS-seq)，對這些胚胎中的miRNAs的表達(dá)豐度進(jìn)行了定量研究，發(fā)現(xiàn)具有高甲基化啟動子的miRNAs，幾乎在Dnmt-null的胚胎中都出現(xiàn)了上調(diào)，而Dnmt-null胚胎中下調(diào)表達(dá)的基因也大多屬于這些上調(diào)的miRNAs預(yù)測的靶基因。有趣的是，這些上調(diào)的miRNAs絕大部分都位于一個重要的印記調(diào)控區(qū)域Dlk1-Dio3，因此，研究人員首先證明了Dlk1-Dio3的差異甲基化區(qū)域(IG-DMR)和啟動子區(qū)域的甲基化都會對這些miRNAs的表達(dá)產(chǎn)生影響。進(jìn)一步，他們在小鼠類精子胚胎干細(xì)胞中將這個IG-DMR區(qū)域刪除模擬它的甲基化狀態(tài)，同時敲除了6個Dnmt-null胚胎中上調(diào)的miRNAs(let-7b, miR-127, miR-541, miR-369, miR-540, miR-409)。將這種改造的類精子胚胎干細(xì)胞注入小鼠MII卵子后，再敲除Dnmt家族基因，發(fā)現(xiàn)獲得的Dnmt-null胚胎在E7.5的原條發(fā)育可以實現(xiàn)部分回補(bǔ)，暗示這些上調(diào)的miRNAs在抑制Dnmt-null胚胎發(fā)生原腸運(yùn)動中發(fā)揮著重要的作用。然而這些胚胎仍然未能完成原腸運(yùn)動，說明在甲基化完全缺失的胚胎中，依然存在著其它未知的因素影響原腸運(yùn)動的發(fā)生，這將有待進(jìn)一步更加細(xì)致地分析研究。

　　綜上，該研究建立了體內(nèi)多基因同時敲除的IMGZ系統(tǒng)，探究了DNMT和TET家族蛋白在小鼠胚胎發(fā)育過程中的功能關(guān)系，發(fā)現(xiàn)DNMT在調(diào)控小鼠胚胎發(fā)育過程中是不依賴于TET家族蛋白的;首次發(fā)現(xiàn)Dnmt-null的胚胎會導(dǎo)致小鼠原腸運(yùn)動發(fā)生的失敗，且發(fā)現(xiàn)甲基化調(diào)控的一些miRNAs的表達(dá)劑量，對于胚胎原腸運(yùn)動的發(fā)生發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。這些研究加深了DNA甲基化對于胚胎發(fā)育調(diào)控的理解，同時將為探究冗余基因在胚胎發(fā)育過程中的功能機(jī)制提供了重要的研究系統(tǒng)和范例。

　　分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心副研究員李慶、博士研究生印熙娣、常允建、博士后王超，北京大學(xué)博士研究生盧健森和杭州高等研究院博士后晏萌為該論文的共同第一作者。分子細(xì)胞卓越中心李勁松研究員、吳立剛研究員、徐國良研究員和北京大學(xué)湯富酬教授為該論文的共同通訊作者。該工作得到中國科學(xué)院、基金委、科技部、上海市科委和博士后基金會等部門的經(jīng)費(fèi)資助。李慶博士感謝賽諾菲優(yōu)秀青年人才獎勵基金的資助。

　　文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-38528-z

IMGZ系統(tǒng)介導(dǎo)的Tet和Dnmt家族基因多種組合敲除胚胎的表型