6月12日，國際學術期刊《美國國家科學院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America)在線發(fā)表了國科大杭州高等研究院生命與健康學院/中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心周斌研究組與復旦大學醫(yī)學分子病毒學教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院重點實驗室陸路課題組合作研究成果“An inducible hACE2 transgenic mouse model recapitulates SARS-CoV-2 infection and pathogenesis in vivo”。該研究利用Cre-loxP遺傳譜系示蹤技術與人源化hACE2結合，創(chuàng)建了一種誘導型hACE2小鼠模型，結合細胞特異性Cre工具小鼠可實現(xiàn)在靶細胞中特異性表達hACE2蛋白并同時對靶細胞進行遺傳示蹤。此誘導型hACE2小鼠模型不僅適用于對SARS-CoV-2藥物篩選和疫苗評價，還可應用于SARS-CoV-2感染相關的細胞機制和遺傳學研究。

　　新型冠狀病毒感染(COVID-19)是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)引起的急性呼吸道傳染病。盡管目前全世界已經步入后疫情時代，但疫情并未完全消失，依然會出現(xiàn)小規(guī)模傳播或波浪式流行態(tài)勢，其重癥患者易出現(xiàn)一系列嚴重的并發(fā)癥，威脅患者生命健康。病毒變異具有隨機性，因此構建適用于SARS-CoV-2等可利用ACE2受體感染的各類冠狀病毒(包括SARS-CoV及SARS相關冠狀病毒、HCoV-NL63等)研究的小鼠模型對于研究SARS-CoV-2等致病機理并測試新型治療方案，應對將來未知風險具有重要意義。

　　SARS-CoV-2可通過識別人體細胞表面的血管緊張素轉換酶2(hACE2)進入人體細胞。人體中多種組織臟器表達hACE2，例如上呼吸道、肺臟、心臟、肝臟、腎臟、腸道和大腦等等，因此這些器官都會被SARS-CoV-2識別并攻擊。肺部是SARS-CoV-2攻擊的首要目標。人類肺臟中多種上皮細胞類型表達hACE2，包括I型肺泡上皮細胞(AT1細胞)、II肺泡上皮細胞(AT2細胞)、分泌細胞(club細胞)、基底細胞(basal細胞)和纖毛細胞(ciliated細胞)等。其中AT2細胞負責肺泡上皮受損后的再生修復，人體AT2細胞高表達hACE2，是SARS-CoV-2在肺部的重要攻擊對象之一。

　　人源化小鼠是研究人類疾病的重要模型，研究發(fā)現(xiàn)小鼠細胞血管緊張素轉換酶2(mACE2)不易于被SARS-CoV-2識別，因此構建的人源化hACE2新冠小鼠感染模型被廣泛應用于新冠病毒感染相關研究。目前已報道多種人源化hACE2轉基因模型小鼠，這些hACE2的表達受Krt8，HFH4，CAG或mACE2啟動子驅動。然而Krt8在肺臟主要表達在支氣管管腔上皮細胞，HFH4主要表達在支氣管ciliated細胞，CAG為廣譜型啟動子在所有細胞類型表達。在本研究中，研究人員構建了mACE2-2A-CreER;R26-tdTomato工具小鼠并揭示在小鼠肺臟中mACE2主要表達在支氣管club細胞中。因此，基于上述啟動子構建的hACE2轉基因工具均無法完全模擬人體內hACE2的表達譜，特別是對AT2細胞的靶向。為了解決這一問題，研究人員將CAG-loxp-stop-loxp-hACE2-IRES-tdTomato序列插入到Rosa26基因位點，構建了一種可誘導型hACE2轉基因模型小鼠，簡稱為R26-hACE2-tdT。R26-hACE2-tdT的工作原理為，當發(fā)生Cre-loxP重組，Cre⁺細胞會同時表達hACE2和tdTomato蛋白，由于這種同源重組發(fā)生在DNA水平，所以Cre⁺細胞及其所有子代細胞均會永久性表達hACE2并被標記為tdTomato。針對以上提到的已有hACE2工具細胞靶向的不足，R26-hACE2-tdT可以結合細胞特異性表達Cre的工具小鼠，實現(xiàn)細胞特異性及高效性靶向標記，以精確模擬和應用于SARS-CoV-2攻擊人體細胞的病理研究。

　　為了驗證R26-hACE2-tdT小鼠模型，研究人員以AT2細胞，club細胞和ciliated細胞為例，分別構建了AT2-hACE2、Club-hACE2和Ciliated-hACE2模型小鼠進行SARS-CoV-2感染驗證。因為AT2細胞是已有hACE2模型小鼠首要遺漏標記靶細胞，所以研究人員首先結合AT2細胞特異性工具小鼠Sftpc-CreER構建了AT2細胞特異性表達hACE2小鼠模型：AT2-hACE2(Sftpc-CreER;R26-hACE2-tdT)。對AT2-hACE2小鼠模型進行SARS-CoV-2感染后第4、7、14天(dpi)收樣檢測，發(fā)現(xiàn)肺部AT2細胞可被SARS-CoV-2特異性靶向，病理切片染色顯示4 dpi肺部出現(xiàn)多種病理表型，并與新冠患者病理特征類似，包括肺泡壁增厚、纖維化沉積、免疫細胞浸潤及血細胞滲漏等。這些病理特征在14 dpi得到明顯緩解，并且小鼠肺部病毒載量隨著時間推移呈現(xiàn)下降趨勢，說明SARS-CoV-2感染后致病進程會有一個從嚴重到緩解的過程，這也與多數新冠患者的病情進展一致，隨著時間推移肺炎會緩慢自愈。

　　為了驗證新冠病毒感染工具小鼠對靶細胞的可選擇性，研究人員又結合club細胞特異性工具小鼠Scgb1a1-CreER及ciliated細胞特異性工具小鼠Foxj1-CreER分別構建了Club-hACE2和Ciliated-hACE2模型，進行SARS-CoV-2感染后第4、7、14天(dpi)收樣檢測。同樣的，研究人員檢測到了與新冠患者肺部相似的病理特征，包括肺部纖維化、免疫細胞浸潤及血細胞滲漏等。隨著時間推移，肺部病理特征也具有從嚴重到緩解的過程。與AT2-hACE2模型不同的是，Club-hACE2和Ciliated-hACE2模型感染后病理損傷會在支氣管周圍有積聚趨勢，說明不同細胞類型感染后或不同區(qū)域感染后引起的病理表型具有差異性。然而新冠病毒感染者肺部炎癥發(fā)展是多種細胞被感染后的綜合性表現(xiàn)，其中每種類型細胞對感染的響應是否具有差異，是否可以針對這種差異開展細胞靶向治療是未來需要探究的問題之一。綜上，本研究基于Cre-loxP技術成功構建了可誘導型人源化hACE2小鼠模型，可搭配細胞特異性Cre遺傳工具，不僅適用于對靶細胞特異性SARS-CoV-2感染研究、藥物篩選、疫苗評價，還可應用于感染后組織再生修復的遺傳學等研究。

　　國科大杭州高等研究院周斌課題組副研究員劉擴、中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心博士研究生唐慕雪、復旦大學青年副研究員徐巍為該論文共同第一作者。杭州高等研究院生命與健康學院/中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心周斌研究員和復旦大學醫(yī)學分子病毒學教育部/衛(wèi)健委/醫(yī)科院重點實驗室陸路研究員為該論文共同通訊作者。該工作得到中國科學院、基金委、科技部、上海市科委、杭高院等經費支持。

　　文章鏈接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2207210120

圖注：誘導型hACE2轉基因小鼠模型的構建及應用策略

(A)R26-hACE2-tdT構建策略。(B，C)結合細胞特異性Cre工具，可實現(xiàn)在靶細胞中特異性表達hACE2并被永久性遺傳標記。