北京時(shí)間4月24日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Cell以Research Article的形式在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心(生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所)孟飛龍研究組的最新成果“Mesoscale DNA Feature in Antibody-Coding Sequence Facilitates Somatic Hypermutation”。該研究基于經(jīng)典生化方法與高通量測(cè)序技術(shù)，建立了體外檢測(cè)抗體基因超突變的一系列新方法，從而揭示了抗體基因互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)通過高度柔性特征引發(fā)超高突變的分子機(jī)理。胞苷脫氨酶AID在B淋巴細(xì)胞中啟動(dòng)了抗體基因超突變，其蛋白表面具有大片正電荷片區(qū);而抗體基因CDR編碼區(qū)域DNA序列則在進(jìn)化中獲得了高度柔性的特征。酶與底物的協(xié)同進(jìn)化共同促進(jìn)了CDR區(qū)的超突變偏好。該工作為下一代抗體基因人源化動(dòng)物模型的設(shè)計(jì)提供了底層理論。

　　抗體作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵效應(yīng)分子，時(shí)刻守衛(wèi)著機(jī)體的健康。面對(duì)復(fù)雜多變的外界環(huán)境，機(jī)體的免疫系統(tǒng)通過抗體多樣化機(jī)制產(chǎn)生數(shù)量龐大的抗體分子，從而特異性地識(shí)別和清除病原體?？贵w多樣化通常包含兩個(gè)主要步驟，(1)核酸內(nèi)切酶RAG介導(dǎo)的的V(D)J重排過程;(2)胞苷脫氨酶AID起始的體細(xì)胞超突變(SHM)和抗體類型轉(zhuǎn)換(CSR)過程。體細(xì)胞超突變可在抗體基因的可變區(qū)編碼區(qū)引入高頻突變。但是，超突變?cè)诳贵w可變區(qū)外顯子上并非均勻分布，而偏好性積累在可變區(qū)中的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。超突變?yōu)槭裁淳哂衅眯?，在上世紀(jì)八十年代由著名免疫學(xué)家David Baltimore與Klaus Rajewsky提出。近40多年來，這一領(lǐng)域嘗試從多個(gè)角度去解釋這一現(xiàn)象，但一直都沒有令人非常信服的結(jié)論。CDR偏好突變科學(xué)問題的解決亟需引入新的概念。胞苷脫氨酶AID是一個(gè)僅含198個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。生化實(shí)驗(yàn)證明AID作用于單鏈DNA底物，并且偏好作用于WRC(W=A/T, R=A/G)基序。但是WRC基序并不能解釋抗體基因CDR偏好超突變，因?yàn)橥瑯拥腤RC基序在CDR編碼區(qū)突變率超高。在CDR編碼區(qū)的中尺度(5-50bp)中，AID可能受到局部序列的調(diào)控。

　　孟飛龍研究組長(zhǎng)期致力于免疫受體多樣化機(jī)制研究。在最新的這項(xiàng)研究中，他們從經(jīng)典的生化方法出發(fā)聯(lián)合高通量測(cè)序技術(shù)，首先建立了體外檢測(cè)抗體基因突變的新體系，發(fā)現(xiàn)AID酶活反應(yīng)重現(xiàn)了小鼠體內(nèi)抗體基因突變譜式。隨后，他們將生化實(shí)驗(yàn)的DNA底物擴(kuò)展到27種有頜脊椎動(dòng)物的1000余條抗體基因序列，發(fā)現(xiàn)CDR突變偏好在使用體細(xì)胞高頻突變(SHM)作為抗體主要多樣化策略的四足動(dòng)物(包括人、恒河猴、食蟹猴、小鼠、大鼠、狗、鴨嘴獸以及羊駝等)中高度保守。那么這種突變偏好是否受DNA序列上下文的影響呢?

　　為了回答這個(gè)問題，研究人員在小鼠體內(nèi)將一段抗體基因的DNA序列進(jìn)行隨機(jī)置換，發(fā)現(xiàn)序列改變后突變頻率發(fā)生了顯著變化。這一結(jié)果提示不同的DNA序列上下文中可能含有未知的中尺度順式因子，從而調(diào)控突變頻率的作用。因此，研究人員通過基因編輯在CDR3區(qū)引入隨機(jī)序列改變，快速獲得了十幾種攜帶不同CDR3序列環(huán)境的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)序列改變?cè)娇拷麮DR3區(qū)內(nèi)的突變熱點(diǎn)對(duì)該位點(diǎn)的突變頻率影響越大。因此，研究人員繼續(xù)將序列上下文范圍縮小到突變位點(diǎn)上下游各12-15 nt。

　　通過分子動(dòng)力學(xué)模擬和多種單分子生化實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)中尺度中DNA序列柔性越大越有利于結(jié)合AID表面的正電荷片區(qū)，進(jìn)而越有助于突變的發(fā)生。單鏈DNA的柔韌性與嘧啶-嘧啶二核苷酸的含量呈正相關(guān)。此外，通過分析抗體基因序列特征以及突變譜式，研究人員發(fā)現(xiàn)抗體基因CDR的編碼序列在進(jìn)化中獲得了高度柔性的特征。最后，研究人員分別在B細(xì)胞系和小鼠體內(nèi)將一段柔性序列插入突變低頻區(qū)FR，發(fā)現(xiàn)柔性序列極大地提高了FR的突變頻率。

　　綜上，該研究解答了長(zhǎng)期困擾這一領(lǐng)域的難題，發(fā)現(xiàn)抗體基因CDR編碼區(qū)DNA柔性促進(jìn)了偏好性突變的發(fā)生，抗體基因編碼序列具有調(diào)控AID突變靶向的非編碼功能。這一工作為DNA力學(xué)性質(zhì)參與調(diào)控細(xì)胞生命過程中提供了例證，也提示DNA柔性等力學(xué)性質(zhì)可能在其他生命活動(dòng)如腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。中尺度序列特征的發(fā)現(xiàn)，為設(shè)計(jì)下一代抗體基因人源化動(dòng)物模型構(gòu)筑了底層理論。

　　分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心博士生王燕燕為該論文的第一作者，中心孟飛龍研究員和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院葉菱秀研究員為該論文的共同通訊作者。上海師范大學(xué)數(shù)學(xué)系博士生張森欣在數(shù)據(jù)分析，上海交通大學(xué)博士生楊欣瑞在分子動(dòng)力學(xué)模擬，哈佛大學(xué)Joyce Hwang和王寵在模型構(gòu)建等方面作出重要貢獻(xiàn)。該工作得到上海交通大學(xué)達(dá)林泰教授、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院鄭小琪教授、哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Frederick W. Alt教授、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)趙要風(fēng)教授、瑞典卡羅林斯卡研究所Qiang Pan-Hammarstrom教授、中國(guó)科學(xué)院杭州醫(yī)學(xué)所宋杰研究員、中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所黃韶輝研究員、復(fù)旦大學(xué)曹志偉教授、分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心劉珈泉研究員等合作實(shí)驗(yàn)室老師和同學(xué)的大力支持。該工作得到分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)、細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)、分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)的支持，同時(shí)得到來自基金委、科技部、中國(guó)科學(xué)院、上海市科委等部門的經(jīng)費(fèi)支持。

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DNA柔性在抗體基因超突變中的生理功能