1月10日，國際學(xué)術(shù)期刊Cell Discovery在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌研究組與復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院王利新研究組合作的研究文章“Coronary vessels contribute to de novo endocardial cells in the endocardium-depleted heart”。該研究利用雙同源重組酶介導(dǎo)的譜系示蹤技術(shù)揭示了心臟冠狀血管轉(zhuǎn)變?yōu)樾膬?nèi)膜的潛能。
在心臟的發(fā)育過程中，冠狀血管主要來源于兩群祖細(xì)胞，第一群祖細(xì)胞為將血液循環(huán)回心臟的靜脈竇(sinus venous, SV)，另一群祖細(xì)胞則是排列在心腔內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞層，也即心內(nèi)膜(endocardium)。在小鼠的心臟中，靜脈竇來源的冠狀血管主要分布在心室壁的外側(cè)，而心內(nèi)膜來源的冠狀血管主要分布在心室壁的內(nèi)側(cè)。先前已有文章表明，在靜脈竇來源的冠狀血管缺失時，心內(nèi)膜來源的冠狀血管能夠向外擴(kuò)展并代償缺失的冠狀血管。盡管在成體心臟中，心內(nèi)膜貢獻(xiàn)給冠狀血管的能力喪失，但在特定的損傷條件以及生長因子的刺激下，這個過程又會被重新激活，這表明了在心臟的修復(fù)與再生過程中有著強(qiáng)大的細(xì)胞可塑性。另外，心內(nèi)膜在心臟的發(fā)育過程中會貢獻(xiàn)到心臟的多種細(xì)胞譜系，如成纖維細(xì)胞、周細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，而且心內(nèi)膜在心臟瓣膜形成及心臟正常功能維持中都起著重要作用，這些表明了心內(nèi)膜在心臟生長以及穩(wěn)態(tài)維持中有著至關(guān)重要的角色。盡管近些年來心內(nèi)膜向內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)變已經(jīng)被深入研究，但冠狀血管內(nèi)皮是否能逆轉(zhuǎn)回心內(nèi)膜細(xì)胞仍然未知。揭示特定細(xì)胞轉(zhuǎn)換回祖細(xì)胞狀態(tài)的可塑性對干細(xì)胞研究和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用至關(guān)重要，因此研究人員探究了冠狀血管轉(zhuǎn)換為心內(nèi)膜的能力。
為了高效標(biāo)記心內(nèi)膜細(xì)胞，研究人員首先利用心內(nèi)膜的標(biāo)記物NPR3構(gòu)建了Npr3-tTA的基因敲入小鼠，通過獲得Npr3-tTA;TetO-Cre;R26-lsl-tdT小鼠，其中tTA結(jié)合到TetO序列并激活下游Cre重組酶的表達(dá)，用于NPR3+心內(nèi)膜細(xì)胞的譜系示蹤，對出生后第2天小鼠的心臟進(jìn)行全組織熒光拍照以及免疫熒光染色拍照，在心臟左右心房以及心內(nèi)膜以及室間隔中均出現(xiàn)了tdTomato+的細(xì)胞，證明了用于心內(nèi)膜遺傳靶向的TetO系統(tǒng)的成功構(gòu)建。先前已有研究利用白喉毒素受體(DTR)清除祖細(xì)胞來探究子代細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樽婕?xì)胞的潛能，因此研究人員利用Npr3-tTA;TetO-Cre系統(tǒng)去清除心內(nèi)膜細(xì)胞并檢測冠狀血管內(nèi)皮貢獻(xiàn)到心內(nèi)膜細(xì)胞的潛能。由于心內(nèi)膜細(xì)胞除了血管內(nèi)皮細(xì)胞外還貢獻(xiàn)到多種其他細(xì)胞譜系，而且NPR3也表達(dá)在心外膜中，研究人員使用NPR3與泛內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物CDH5的交集來特異性地清除心內(nèi)膜細(xì)胞及其衍生的內(nèi)皮細(xì)胞。為此，研究人員構(gòu)建了Cre-loxp激活的可誘導(dǎo)性的內(nèi)皮細(xì)胞特異性的DTR小鼠品系(Cdh5-lsl-tdT-DTR)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明tdTomato以及DTR的表達(dá)是Cre重組酶依賴的，并且是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的，因此表明了Cdh5-lsl-tdT-DTR小鼠品系成功構(gòu)建。
通過對獲得的Npr3-tTA;TetO-Cre;Cdh5-lsl-tdT-DTR小鼠進(jìn)行全組織熒光拍照以及免疫熒光染色拍照，研究人員證明了tdTomato與DTR表達(dá)在NPR3+心內(nèi)膜及其衍生的內(nèi)皮細(xì)胞。研究人員對新生小鼠注射白喉毒素(DT)后不同時間點(diǎn)進(jìn)行收樣分析，通過對心內(nèi)膜細(xì)胞的標(biāo)記物PLVAP以及tdTomato進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)，注射DT后第五天，幾乎所有的tdTomato+的細(xì)胞都被清除了并開始了心內(nèi)膜的重塑。通過TUNEL實(shí)驗(yàn)證明了DT確實(shí)誘導(dǎo)了大量細(xì)胞凋亡。通過對DT清除后5天的心臟連續(xù)切片進(jìn)行tdTomato以及內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31免疫熒光染色，結(jié)果表明，DT處理的小鼠心臟中會有冠狀血管與心內(nèi)膜連接的現(xiàn)象，而在沒有DT處理的心臟中則沒有這樣的連接現(xiàn)象存在。這些結(jié)果表明冠狀血管可能參與心內(nèi)膜的修復(fù)過程。
為了進(jìn)一步探究冠狀血管是否能夠在心內(nèi)膜清除的情況下貢獻(xiàn)到心內(nèi)膜中去，研究人員利用了在新生小鼠冠狀血管中大量表達(dá)但不在心內(nèi)膜表達(dá)的標(biāo)志物APLN，研究人員交配得到Apln-DreER;R26-RSR-GFP; Npr3-tTA;TetO-Cre; Cdh5-lsl-tdT-DTR雙同源重組系統(tǒng)小鼠，以此在清除心內(nèi)膜細(xì)胞內(nèi)皮譜系的同時，將冠狀血管遺傳標(biāo)記上GFP熒光蛋白。研究人員給新生期1天(P1)的小鼠給予他莫昔芬處理并在P3天給予DT處理，在P14進(jìn)行收樣分析。免疫熒光染色結(jié)果表明在DT處理后的心臟中出現(xiàn)了GFP+CD31+的心內(nèi)膜細(xì)胞，并通過對PLVAP免疫熒光染色證明了心腔內(nèi)側(cè)GFP+的細(xì)胞確實(shí)是心內(nèi)膜細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明GFP+的冠狀血管貢獻(xiàn)到2.06 ±0.31%的心內(nèi)膜。而在沒有DT處理的心臟中則沒有GFP+的心內(nèi)膜細(xì)胞出現(xiàn)。給予R26-RSR-GFP; Npr3-tTA;TetO-Cre; Cdh5-lsl-tdT-DTR小鼠DT處理后，也沒有在心臟中發(fā)現(xiàn)GFP+的細(xì)胞出現(xiàn)，表明沒有發(fā)生Cre-rox的交叉重組，進(jìn)一步證明了該系統(tǒng)的可信性。以上結(jié)果表明在心內(nèi)膜清除的情況下，冠狀血管能夠轉(zhuǎn)變?yōu)樾膬?nèi)膜細(xì)胞。為了進(jìn)一步更詳細(xì)地探究冠狀血管向心內(nèi)膜的轉(zhuǎn)變過程，研究人員給P1注射了他莫昔芬的新生小鼠在P3注射了更低劑量的DT，通過對心臟切片進(jìn)行免疫熒光染色分析，在P7的心臟切片中發(fā)現(xiàn)了與心內(nèi)膜相連通的GFP+的冠狀血管，并且在P14的心臟切片中發(fā)現(xiàn)了折疊進(jìn)心室壁的GFP+PLVAP+的心內(nèi)膜細(xì)胞以及GFP+PLVAPlow的細(xì)胞與PLVAP+的心內(nèi)膜相連接的現(xiàn)象，以上這些結(jié)果都表明了血管內(nèi)皮能夠動態(tài)持續(xù)轉(zhuǎn)換為心內(nèi)膜細(xì)胞來參與心內(nèi)膜的損傷后重建。另外，通過對P1注射了他莫昔芬的成體Apln-DreER;R26-RSR-GFP; Npr3-tTA;TetO-Cre; Cdh5-lsl-tdT-DTR小鼠進(jìn)行DT處理，研究人員發(fā)現(xiàn)成體小鼠心臟的冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞在心內(nèi)膜清除后仍保持著轉(zhuǎn)變?yōu)樾碌男膬?nèi)膜細(xì)胞的潛能。
綜上，周斌組研究人員構(gòu)建了兩個新的小鼠品系Npr3-tTA與Cdh5-lsl-tdT-DTR來實(shí)現(xiàn)特異性清除心內(nèi)膜及其衍生的內(nèi)皮細(xì)胞譜系，隨后研究人員利用雙同源重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了在清除心內(nèi)膜的同時示蹤冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果表明殘留的冠狀血管內(nèi)皮會向心內(nèi)膜遷移并與與其連通，通過進(jìn)一步表達(dá)心內(nèi)膜的標(biāo)志物轉(zhuǎn)變?yōu)樾膬?nèi)膜細(xì)胞。該研究揭示了冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生新心內(nèi)膜細(xì)胞的高度細(xì)胞可塑性，并再次證明了盡管祖細(xì)胞-衍生細(xì)胞的層次結(jié)構(gòu)被建立，但在這些離散的內(nèi)皮細(xì)胞類型之間的邊界可以在誘導(dǎo)基因程序激活時被覆蓋。
分子細(xì)胞卓越中心博士生張銘珺和副研究員蒲文娟為該論文共同第一作者。分子細(xì)胞卓越中心周斌研究員與復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院王利新醫(yī)生為該論文的共同通訊作者。該工作也得到了牛津大學(xué)Nicola Smart的大力支持。感謝分子細(xì)胞卓越中心動物平臺和細(xì)胞分析技術(shù)平臺對本研究的大力支持，感謝中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部門的經(jīng)費(fèi)支持。
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41421-022-00486-z
冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞在心內(nèi)膜細(xì)胞清除后轉(zhuǎn)化為心內(nèi)膜細(xì)胞
