4月11日，國際學術(shù)期刊Circulation 在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心周斌研究組題為“Dual Genetic Lineage Tracing Reveals Capillary to Artery Formation in the Adult Heart”的最新研究成果。該研究利用雙同源重組酶介導(dǎo)的遺傳譜系示蹤技術(shù)高效且清晰地記錄成體心臟損傷過程中毛細血管形成冠狀動脈的過程，揭示了毛細血管動脈化在成體心肌缺血模型中的重要作用，為受損心臟的血管修復(fù)和治療提供了新的研究方向，為心血管再生醫(yī)學提供了新思路。
冠狀動脈疾病一直是全人類致死率最高的疾病之一。冠狀動脈一旦發(fā)生病變，將阻礙血液有效流向心肌，導(dǎo)致心肌組織缺乏必需的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，從而引發(fā)心肌梗死。如何使病變的冠狀動脈再度發(fā)揮血流作用（血運重建）或者刺激新的冠狀動脈生成一直是該領(lǐng)域研究者努力的方向。支架植入和冠狀動脈旁路移植技術(shù)的開發(fā)與發(fā)展使得血運重建成為可能，挽救了部分患者的生命。側(cè)支動脈的形成為新生期梗死的心臟提供血流，從而緩解心臟衰竭。然而，有一定數(shù)量的患者由于身體原因不能接受血運重建的治療，而側(cè)支動脈的形成目前仍受限于新生期。因此，深入探究新生冠狀動脈來源及形成機制將為心臟損傷后血管的修復(fù)與再生提供新的策略或方法。
目前，關(guān)于側(cè)支動脈新生有兩種解釋模型。一種是動脈發(fā)生（Arteriogenesis），即預(yù)先存在的動脈通過快速的管腔開放和血管壁增厚產(chǎn)生側(cè)支動脈（Helisch A et al.，Microcirculation 2003）；另一種是動脈化（Arterialization），即毛細血管通過血管生成進行血管重塑，并招募周細胞和平滑肌細胞，以產(chǎn)生側(cè)支動脈（Faber JE et al.，Arterioscler Thromb Vasc Biol 2014）。鑒于在成體心肌梗死過程中很少觀察到毛細血管通過動脈化產(chǎn)生冠狀動脈（He et al.，Cardiovasc Res 2016），目前的主流觀點更偏向于用動脈發(fā)生模型解釋新生的冠狀動脈。然而，隨著技術(shù)的發(fā)展，冠狀動脈新生的方式仍需進一步研究。
為靈敏且干凈地檢測到從毛細血管衍生出的動脈，研究人員在雙同源重組酶介導(dǎo)的譜系示蹤技術(shù)（He et al., Nature Medicine 2017）的基礎(chǔ)上，建立了無縫隙捕捉毛細血管動脈化的新系統(tǒng)。前人的研究之所以很難在成體捕捉到毛細血管動脈化的過程，有以下兩層阻礙。首先，毛細血管的分子標志物——Apln在成體心臟中只活躍于部分血管新生的毛細血管而非動脈內(nèi)皮細胞，這就使得在成體心臟中高效地標記毛細血管內(nèi)皮細胞成為一個技術(shù)難題。其次，若單純標記毛細血管，想要在無數(shù)的毛細血管中找出由毛細血管動脈化產(chǎn)生的少量動脈無異于大海撈針，這種低分辨率的方法很容易讓研究者忽視掉由毛細血管動脈化產(chǎn)生的動脈。為克服以上阻礙，周斌組研究人員利用Cdh5-DreER, Apln-CrexER和Cx40-LSL-GFP 三個小鼠品系，建立了一個在小鼠心臟中只標記由毛細血管衍生而來的動脈的系統(tǒng)。Cdh5-DreER是內(nèi)皮特異性的小鼠品系，Apln-CrexER是毛細血管特異性的小鼠品系。Cx40-LSL-GFP可將動脈標記成綠色。當受到他莫昔芬的誘導(dǎo)后，Cdh5-DreER的DreER便會入核，切掉Apln-CrexER的rox-ER-rox，使得Apln-CrexER變成持續(xù)表達的Apln-Cre，而一旦表達Apln的細胞中的Cx40基因啟動，那么Apln-Cre的Cre就會入核，切掉Cx40-LSL-GFP的loxP-stop-loxP，使得該細胞亮綠色，也就是表達過Apln的毛細血管衍變成動脈（表達Cx40）后就會被綠色標記（圖A）。該系統(tǒng)通過將Apln-CrexER變成Apln-Cre，突破了Apln-CreER只能在成體心臟中標記新生毛細血管的限制，同時通過Cdh5-DreER保留了用他莫昔芬作為誘導(dǎo)事件發(fā)生的優(yōu)勢。其次，研究人員引入Cx40-LSL-GFP作為報告基因，將熒光標記限制在表達Cx40的動脈中，做到了只看毛細血管衍生的動脈，克服了標記所有毛細血管的缺陷。利用這套靈敏且清晰的系統(tǒng)，研究人員期望在心臟損傷過程中記錄所有毛細血管動脈化產(chǎn)生動脈的事件。
為了檢測該系統(tǒng)是否符合預(yù)期，研究人員基于新生期仍發(fā)生毛細血管動脈化的既有知識，對新生的Cdh5-DreER;Apln-CrexER;Cx40-LSL-GFP三基因型小鼠開展實驗。研究人員對p0天的三基因小鼠注射他莫昔芬，在p2天對該小鼠進行心肌缺血（MI）手術(shù)，p6天收取該小鼠的心臟進行分析（圖B）。全組織熒光照片的結(jié)果表明，MI 后形成了清晰的GFP+側(cè)支動脈，MI組的動脈數(shù)量較未損傷組要多，且通過免疫熒光染色共染平滑肌的標志物aSMA與GFP, 證實GFP陽性的細胞都被aSMA包裹，表明毛細血管動脈化形成了側(cè)支動脈（圖B）。以上結(jié)果既表明該系統(tǒng)可用于追蹤毛細血管動脈化產(chǎn)生的新動脈，也揭示了在新生期心臟損傷修復(fù)過程中的毛細血管內(nèi)皮細胞貢獻給側(cè)支動脈的重要生物學過程。
為了在成體損傷情況下探究毛細血管動脈化產(chǎn)生動脈的情況，研究人員對8周大的Cdh5-DreER;Apln-CrexER;Cx40-LSL-GFP三基因型小鼠進行他莫昔芬注射，為避免他莫昔芬殘留對實驗結(jié)果的影響，研究人員在他莫昔芬注射后兩周才對小鼠進行心梗手術(shù)（圖C）。為探究不同心梗類型下毛細血管的動脈化，研究人員引入了三種心梗模型，包括主動脈弓縮窄手術(shù)（TAC），心肌缺血再灌注（MI/R）和心肌缺血（MI）。全組織熒光照片的結(jié)果顯示，在TAC和MI/R心梗模型下幾乎看不到GFP陽性的信號，而MI后可看到明顯的GFP陽性的血管形態(tài)（圖C）。為了更加精細地探究該GFP陽性的細胞是否是動脈內(nèi)皮細胞，研究人員對三種心梗模型中收到的心臟組織分別進行切片染色，利用免疫熒光染色的實驗技術(shù)，將GFP與aSMA、SM22、SM-MHC三種平滑肌細胞的標志物共染。結(jié)果表明，MI后出現(xiàn)的GFP陽性的細胞確實被aSMA、SM22、SM-MHC陽性的平滑肌細胞包裹，證實該由毛細血管衍生而來的GFP陽性的細胞是動脈內(nèi)皮細胞（圖D）。此外，對TAC和MI/R模型下得到的心臟樣本進行連續(xù)切片，均沒有檢測到GFP信號，為排除該系統(tǒng)在這兩種模型下效率較低的可能，研究人員引入了R26-LSL-tdTomato的小鼠，對Cdh5-DreER;Apln-CrexER;Cx40-LSL-GFP;R26-LSL-tdTomato進行TAC或者MI/R，收取其心臟樣本進行切片染色，發(fā)現(xiàn)大量的tdTomato信號（圖E），該結(jié)果表明，在TAC和MI/R模型下，Cdh5-DreER可以高效率切除Apln-CrexER的rox-ER-rox，使得Apln-Cre得以進一步切除R26-LSL-tdTomato的loxP-stop-loxP, 從而將毛細血管內(nèi)皮細胞標記成tdTomato。因此，研究人員推斷，TAC或者MI/R心梗模型下沒有檢測到GFP陽性的動脈內(nèi)皮細胞，不是由于系統(tǒng)效率的原因，而是在這兩種損傷模型下，心臟的缺血程度不足以刺激毛細血管動脈化的發(fā)生。換言之，在嚴重的MI心梗模型下，存在毛細血管動脈化產(chǎn)生新的冠狀動脈。
綜上，周斌組研究人員基于實驗室建立的雙同源重組酶介導(dǎo)的譜系示蹤技術(shù)，開發(fā)出一套更加靈敏且清晰的系統(tǒng)，實現(xiàn)了在成體損傷條件下追蹤毛細血管動脈化產(chǎn)生動脈的目標。這項研究結(jié)果豐富了成體損傷條件下新生動脈來源的知識，為心臟損傷后血管修復(fù)與再生治療提供了新思路。
分子細胞卓越中心博士研究生韓茂瑩和劉子鑫為該論文的共同第一作者，周斌研究員為該論文通訊作者。該工作也得到了復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院顏彥教授和香港中文大學Kathy O. Lui教授的大力支持。感謝分子細胞卓越中心動物平臺和細胞分析技術(shù)平臺對本研究的大力支持，感謝中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部門的經(jīng)費支持。
文章鏈接：https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/CIRCULATIONAHA.121.056249
