10月1日， 國際學術期刊 Nature Communications 在線發(fā)表了中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心（生物化學與細胞生物學研究所）周斌組與上海交通大學胸科醫(yī)院何奔組合作的研究成果“Cell proliferation fate mapping reveals regional cardiomyocyte cell-cycle activity in subendocardial muscle of left ventricle”。該研究首次利用細胞增殖示蹤技術ProTracer研究了哺乳動物成體小鼠心臟中心肌細胞的增殖活性，揭示了成體后心臟心肌細胞增殖的位置具有特異性，為心肌細胞增殖和心臟修復再生研究提供了新的檢測工具以及研究思路。
成體哺乳動物心臟中心肌細胞以很低的速率進行更新?lián)Q代，因此在心臟損傷后不能及時再生，給心臟造成不可逆的損傷，同時極低的增殖速率也給檢測心肌細胞的增殖帶來了挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)檢測心肌細胞增殖的方法多是利用細胞增殖標記物染色，同位素摻入，核酸類似物摻入進行檢測，但是這些傳統(tǒng)檢測方法在檢測心肌細胞增殖時面臨多種問題：只能檢測單一時間點，無法進行長時程的追蹤；心肌增殖的信號被其他類型細胞增殖的信號干擾，無法進行明確分辨；若借助流式細胞技術則很難提供原位的細胞增殖信息；長時間的核酸類似物摻入可能導致細胞的正常分裂受到影響。因此建立一種可以長時間特異性追蹤心肌細胞增殖的技術對于解決心肌細胞增殖的問題至關重要。
基于上述存在的問題，周斌組研究人員利用譜系示蹤技術建立了一種檢測細胞增殖的技術——ProTracer，它可以特異性追蹤體內心肌細胞的增殖。研究人員基于廣泛應用的細胞增殖標記物Ki67構建了此前報道過的Ki67-CrexER小鼠（He et al., Science 2021），結合研究組開發(fā)的Dre-rox與Cre-loxP雙同源重組系統(tǒng)，使得在Dre存在的情況下可以將Ki67-CrexER轉變成Ki67-Cre，從而根據(jù)Cre重組loxP報告基因的結果持續(xù)追蹤Ki67基因的活性。之前細胞增殖領域內已經(jīng)存在的Ki67-CreER譜系示蹤小鼠，需要借助持續(xù)他莫昔芬（Tamoxifen, Tam）的誘導才有可能持續(xù)捕捉Ki67的活性。由于Tam在體內的作用時間較短，如果細胞發(fā)生了Ki67的活躍表達驅動了 CreER的表達但是體內此時沒有可以讓Cre入核的Tam，那么該細胞并不能被標記熒光，這部分信號將被遺漏。ProTracer系統(tǒng)可以依靠Tam驅動DreER入核將Ki67-CrexER同源重組變成Ki67-Cre，只要細胞進入細胞周期，Ki67開始活躍就會驅動Cre的表達并利用報告基因永久標記細胞。ProTracer一旦經(jīng)由DreER啟動，后續(xù)就可以持續(xù)不間斷長時程地追蹤細胞的增殖，而且可以根據(jù)DreER的選擇實現(xiàn)特異類型細胞的增殖追蹤，排除其他較快增殖的細胞類型的干擾，實現(xiàn)高分辨率、低信噪比的直觀檢測。
研究人員利用ProTracer研究了穩(wěn)態(tài)以及損傷修復后成體小鼠心臟中心肌細胞進入細胞周期的情況。此前關于成體哺乳動物心肌細胞增殖的研究集中于利用同位素標記來研究人與鼠中心肌細胞的增殖。對人的心肌細胞研究主要在于利用冷戰(zhàn)后14C進入大氣后，以14C在心肌細胞核中的摻入比例推測心肌細胞的出生日期，進而推測人整個生命過程中的心肌細胞增殖速率。研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長心肌細胞的增殖速率變緩，從25歲約1%的年更新率降低至75歲時0.45%的年更新率（Bergmann et al., Science 2009）。另一研究利用多同位素成像質譜對摻入小鼠心肌核的15N同位素進行檢測發(fā)現(xiàn)，小鼠成體后心肌細胞以0.76%的年更新速率更新，心肌梗死后會促進梗死區(qū)邊緣的心肌細胞的增殖（Senyo et al, Nature 2013）。成體哺乳動物的心肌細胞增殖初步在定量上取得了一定進展，但是以往的這些研究借助于流式細胞技術，無法揭示細胞增殖的原始位置；或者引入了同位素使得檢測變得困難，以及受到其他易增殖的細胞信號的影響較難獲得高分辨的原位心肌細胞增殖信息。
研究人員首先利用廣譜性的ProTracer（ProTracer可以在所有類型細胞中被啟動）檢測成體心臟中心肌細胞的增殖，利用流式分析、分離的心肌細胞計數(shù)、切片免疫熒光染色分析，他們發(fā)現(xiàn)小鼠成體心臟進入過細胞周期的心肌細胞隨時間增長逐漸累積，直到半年后達到1.23%左右。考慮到R26-DreER啟動廣譜性ProTracer具有效率問題，該結果與Senyo等的DNA年復制結果是一致的。研究還發(fā)現(xiàn)進入過細胞周期的二倍體的心肌細胞比例明顯高于未進入過細胞周期的比例，這說明了二倍體心肌細胞可能更容易增殖。隨后研究人員利用靶向心肌細胞的腺相關病毒攜帶Dre來開啟ProTracer實現(xiàn)了只追蹤心肌細胞增殖的效果，首先建立了心肌細胞特異的ProTracer技術。排除了其他易增殖的細胞信號的影響，研究人員能夠更直觀地原位檢測心肌細胞增殖。借助心肌細胞特異的ProTracer技術，研究人員發(fā)現(xiàn)成體心臟中進入過細胞周期的心肌細胞更趨向于分布在左心室靠近心內膜側、乳頭肌、室間隔靠近左心室側（后文統(tǒng)稱這些位置為左心室心內膜側肌肉， 圖），統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)80%以上進入過細胞周期的心肌細胞分布于上述位置。為了排除腺相關病毒可能存在的位置靶向性導致的假陽性，研究人員構建了Tnnt2-DreER來開啟ProTracer，借助這一版本的心肌細胞特異性ProTracer，研究人員再一次確認了成體心臟心肌細胞進入細胞周期的位置特異性。利用一套依賴于另一個細胞周期基因Ccna2的ProTracer技術，以及持續(xù)的EdU喂水和Ki67蛋白表達檢測實驗，研究人員最終確認了成體心肌細胞進入細胞周期的這一位置特異性。
ProTracer借助追蹤Ki67在細胞內的活性記錄小鼠體內細胞的增殖，但是Ki67也表達在那些僅僅完成了DNA復制或者核分裂而未完成完整細胞分裂的細胞中，鑒于成體后心肌細胞存在多倍體化和多核化，所以研究人員也一直稱他們檢測到的心肌細胞為進入過細胞周期的心肌細胞。為了進一步研究成體心臟中確切的心肌細胞增殖數(shù)目，研究人員利用低劑量的腺相關病毒來稀疏標記進入過細胞周期的心肌細胞，通過統(tǒng)計位置緊鄰的被標記的心肌細胞來測算完成了細胞周期的心肌細胞的數(shù)目。研究人員發(fā)現(xiàn)大約13%進入過細胞周期的心肌細胞完成了細胞分裂，該結果與Senyo等的同位素摻入結果也是相符合的。而且這些增殖的心肌細胞也有超過80%集中于左心室的心內膜肌肉側。研究人員進一步利用ProTracer技術研究了心臟損傷下的心肌細胞再生來源，他們發(fā)現(xiàn)心肌梗死和主動脈狹窄都會在一定程度上促進心肌細胞進入細胞周期心肌梗死后梗死周圍區(qū)的心肌細胞更多地進入細胞周期。利用ProTracer技術，研究人員也發(fā)現(xiàn)心肌細胞增殖的位置特異性是受Hippo信號通路下游的轉錄因子YAP調控的。
綜上，該研究的亮點在于利用一種新開發(fā)的細胞增殖示蹤技術——ProTracer，發(fā)現(xiàn)了成體后心肌細胞增殖的位置特異性，為心肌增殖研究領域提供了新的研究工具，也為心臟修復再生領域提供了新的研究思路。
分子細胞卓越中心博士研究生劉秀秀、蒲文娟和何靈娟（現(xiàn)西湖大學）為該論文的共同第一作者，分子細胞卓越中心周斌研究員和上海交通大學胸科醫(yī)院何奔教授為該論文共同通訊作者。該工作得到了英國阿斯利康Qing-dong Wang教授，上海交通大學上海胸科醫(yī)院沈紅玲教授，華東師范大學鐘濤教授，上海交通大學新華醫(yī)院孫錕教授和加州大學洛杉磯分校Reza Ardehali教授的大力支持。感謝分子細胞卓越中心動物平臺和細胞分析技術平臺對本研究的大力支持，感謝中科院、基金委、科技部以及上海市科委等部門的經(jīng)費支持。
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-25933-5
圖：研究人員利用心肌細胞特異的ProTracer技術發(fā)現(xiàn)成體心臟進入細胞周期的心肌細胞（圖中綠色熒光標記）具有位置特異性，它們集中在環(huán)左心室的心內膜側肌肉中。冠狀面以及矢狀面心臟切片顯示80%細胞周期活躍的心肌細胞集中于左心室內側。
