11月13日，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊 Nature Medicine 在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所周斌研究組的科研成果“Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases ”。該研究將Dre-rox同源重組系統(tǒng)引入到傳統(tǒng)的基于Cre-loxP同源重組系統(tǒng)的遺傳譜系示蹤技術(shù)中，有效地規(guī)避了由于Cre表達(dá)的不特異性而導(dǎo)致的非特異性（“異位”）同源重組，實(shí)現(xiàn)了更為精準(zhǔn)的遺傳譜系示蹤，為發(fā)育、干細(xì)胞及再生等領(lǐng)域的深入研究奠定了可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。

 

        遺傳譜系示蹤技術(shù)是揭示特定類(lèi)型細(xì)胞在發(fā)育、疾病和再生中轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象的有效 研究方法，目前，體內(nèi)的細(xì)胞追蹤技術(shù)主要基于 Cre-loxP 同源重組系統(tǒng)。在含有 Cre 的轉(zhuǎn)基因小鼠中，Cre 由于在特性基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，表達(dá)在特定的細(xì)胞類(lèi)群中，當(dāng) Cre 小鼠與含有 loxP 位點(diǎn)的報(bào)告基因小鼠交配時(shí)，Cre 通過(guò)識(shí)別 loxP 位點(diǎn)，將兩個(gè) loxP 位點(diǎn)之間的終止序列切除，從而使含有 Cre 的細(xì)胞類(lèi)群表達(dá)出報(bào)告基因，由于這種切除是位于基因上的，從而是永久性的和不可逆的，因此，所有表達(dá) Cre 的細(xì)胞類(lèi)群及其后代（無(wú)論是否表達(dá) Cre）都將永久的被報(bào)告基因蛋白標(biāo)記上，因此，利用該細(xì)胞追蹤技術(shù)可以解析特定細(xì)胞的起源和命運(yùn)。

 

        盡管基于 Cre-loxP 系統(tǒng)的遺傳譜系示蹤技術(shù)是研究發(fā)育、疾病、再生等過(guò)程細(xì)胞命運(yùn)可塑性的強(qiáng)大利器，但是它本身也存在著技術(shù)瓶頸。該技術(shù)的準(zhǔn)確性主要依賴于 Cre 表達(dá)的特異性，如果有微量的 Cre 表達(dá)在了非靶向細(xì)胞中即為所謂的異位表達(dá)，那么譜系示蹤結(jié)果的可靠性將大大降低，而這也成為了近年來(lái)很多科學(xué)問(wèn)題出現(xiàn)爭(zhēng)議的主要原因之一。

 

        為了解決這一技術(shù)瓶頸，何靈娟博士等在周斌研究員指導(dǎo)下開(kāi)發(fā)了一種新的譜系示蹤技術(shù)稱之為DeaLT （Dual-recombinase-activated lineage tracing），該技術(shù)將Dre-rox同源重組系統(tǒng)與傳統(tǒng)的Cre-loxP同源重組系統(tǒng)結(jié)合起來(lái)，Dre-rox 介導(dǎo)的同源重組反應(yīng)在可能引起 Cre 異位表達(dá)的細(xì)胞中將Cre重組酶的識(shí)別位點(diǎn) loxP 切除掉，從而有效地阻止了 Cre-loxP 的異位同源重組，增加了 Cre-loxP 介導(dǎo)的譜系示蹤結(jié)果的準(zhǔn)確性。該系統(tǒng)包含兩種策略，分別是DeaLT-IR 和DeaLT-NR。DeaLT-IR策略的報(bào)告基因小鼠上包含的兩個(gè)loxP位點(diǎn)和兩個(gè)rox位點(diǎn)以交錯(cuò)形式存在（loxP-rox-loxP-rox），該策略適合組成性Dre與誘導(dǎo)性Cre相結(jié)合；而DeaLT-NR策略報(bào)告基因小鼠上的loxP位點(diǎn)和rox位點(diǎn)以嵌合的形式存在（rox-loxP-loxP-rox），該策略適合誘導(dǎo)性Dre和誘導(dǎo)性Cre相結(jié)合。

 

        系統(tǒng)創(chuàng)建成功后，周斌組研究人員首先利用DeaLT-IR策略解決了成體心臟 c-Kit⁺心臟干細(xì)胞的問(wèn)題。成體 c-Kit⁺干細(xì)胞是否能夠分化形成心肌細(xì)胞之所以存在爭(zhēng)議主要是由于 c-Kit 除了表達(dá)在非心肌細(xì)胞中以外，本身還微量地表達(dá)在心肌細(xì)胞中，傳統(tǒng)的示蹤技術(shù)利用Kit-CreER無(wú)法做到單純示蹤c-Kit⁺干細(xì)胞，而利用新開(kāi)發(fā)的DeaLT系統(tǒng)阻斷了心肌細(xì)胞中Kit-CreER的同源重組反應(yīng)，成功的實(shí)現(xiàn)了非心肌細(xì)胞中 c-Kit⁺干細(xì)胞特異性的遺傳譜系示蹤。他們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，c-Kit⁺干細(xì)胞在成體心臟生理穩(wěn)態(tài)和損傷修復(fù)過(guò)程中均不會(huì)分化形成心肌細(xì)胞，主要是通過(guò)血管新生參與心臟修復(fù)。 此外，利用 DeaLT-NR系統(tǒng)他們解決了肝臟領(lǐng)域有關(guān) Sox9⁺肝組細(xì)胞能否轉(zhuǎn)分化形成肝細(xì)胞的爭(zhēng)議問(wèn)題，造成該爭(zhēng)議的主要原因是 Sox9 除了表達(dá)在膽管上皮細(xì)胞中還少量的表達(dá)在了膽管周?chē)母渭?xì)胞里面，傳統(tǒng)的譜系示蹤技術(shù)利用Sox9-CreER標(biāo)記了膽管上皮細(xì)胞和膽管周?chē)囊徊糠指渭?xì)胞，因此很難判斷損傷后Sox9-CreER標(biāo)記的新生成的肝細(xì)胞到底來(lái)自哪一部分。DeaLT技術(shù)阻斷了Sox9-CreER在肝細(xì)胞中的同源重組反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了 Sox9⁺膽管上皮細(xì)胞中特異性的遺傳譜系示蹤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肝臟生理穩(wěn)態(tài)和損傷修復(fù)過(guò)程中 Sox9⁺膽管上皮細(xì)胞并不會(huì)轉(zhuǎn)分化形成肝細(xì)胞。DeaLT策略不僅提供更精確的Cre重組酶的控制，并且為Cre表達(dá)細(xì)胞的譜系追蹤設(shè)定了更高的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，但同時(shí)它也足夠靈敏以檢測(cè)體內(nèi)譜系轉(zhuǎn)換事件。以肝損傷后肝細(xì)胞轉(zhuǎn)分化形成膽管上皮細(xì)胞為例，DeaLT策略能夠清楚地展現(xiàn)肝損傷后肝細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)分化形成膽管上皮細(xì)胞的過(guò)程。因此，這種新策略可用于揭示細(xì)胞命運(yùn)轉(zhuǎn)變，同時(shí)也嚴(yán)格控制潛在的非靶向細(xì)胞表達(dá)Cre介導(dǎo)的異位譜系追蹤，為多個(gè)研究領(lǐng)域更準(zhǔn)確地解析細(xì)胞起源和命運(yùn)提供了有效的手段。

 

         該研究得到了生化與細(xì)胞所季紅斌研究員，北京生命科學(xué)研究所陳婷教授、上海交通大學(xué)附屬國(guó)際和平婦幼保健院黃荷鳳教授，波士頓兒童醫(yī)院William Pu教授，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院顏彥教授、阜外醫(yī)院的胡盛壽及聶宇教授、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所韓忠朝及韓之波教授、暨南大學(xué)蔡冬青教授、同濟(jì)大學(xué)費(fèi)儉教授等大力幫助和支持。該研究工作得到了中科院、基金委、科技部以及上?？莆冉?jīng)費(fèi)支持。