葉蘊華(1936—)，1960年畢業(yè)于北京大學化學系(現(xiàn)名為化學與分子工程學院)，后留校從事有機化學教學與研究工作40余年，歷任助教、講師、副教授、教授、博士生導(dǎo)師。獲國務(wù)院政府特殊津貼。于2000年退休。退休后至今在北京大學世佳研究中心從事中藥現(xiàn)代化的研究。曾為本科生和研究生開設(shè)《有機化學》、《多肽化學》、《生物有機化學》等課程。1964 年作為北大科研組成員之一到上海與中科院上海有機化學研究所及生物化學研究所合作，從事胰島素合成的研究，于1965年在國際上首次完成了結(jié)晶牛胰島素的全合成。主要從事生物活性肽的合成及構(gòu)效關(guān)系的研究；形成肽鍵的含磷縮合試劑的研究；環(huán)肽合成方法及環(huán)化規(guī)律的研究；氨基酸，肽—甾體綴合物的合成與生物活性研究；在非水介質(zhì)中，蛋白水解酶催化酰胺鍵形成的研究；人參屬植物水溶性化學成分的研究等。取得了多項開創(chuàng)性的研究成果，受到國內(nèi)外同行的關(guān)注。
葉蘊華
1 引言
胰島素(insulin) 是一種蛋白質(zhì)類激素。它是人體內(nèi)唯一能降低血糖的激素，也是唯一同時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的激素。它的分子量較小而結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，所以在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究中占有特殊地位。
1921年，加拿大外科醫(yī)生Frederick Grant Banting首次從狗的萎縮胰臟中提取了胰島素，并將初步純化的動物胰島素成功地應(yīng)用于糖尿病患者。基于該項研究成果，Banting與Macleod獲得1923年諾貝爾醫(yī)學和生理學獎。胰島素的發(fā)現(xiàn)被認為是糖尿病研究史上的里程碑，它激發(fā)了各個相關(guān)領(lǐng)域科學家的興趣[1]。
從胰腺中提取的胰島素經(jīng)純化得到結(jié)晶后，英國科學家Sanger從1945年起, 經(jīng)過10年的研究，于1955年報道了牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)[2-3]。因為他測定了生物體中第一個蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，而獲得了1958年諾貝爾化學獎。此后他又測定了豬、羊胰島素的一級結(jié)構(gòu)。
胰島素是由A鏈和B鏈兩條肽鏈共51個氨基酸殘基組成的生物大分子。其種族差異，只在A 或B鏈中的個別氨基酸殘基有所不同。
A鏈含有11種21個氨基酸殘基，N-端為Gly，C-端為Asn。A 鏈的6位和11位上的兩個Cys通過二硫鍵相連成環(huán)；B鏈含有16種30個氨基酸殘基，其N-端為Phe，C-端為Ala。A鏈和B鏈又通過兩對二硫鍵互相連接成胰島素分子。
50多年前，我從北京大學化學系畢業(yè)后，有幸參加了我國合成結(jié)晶牛胰島素A鏈的研究項目。本文通過自己的親身經(jīng)歷和所見所聞分七節(jié)來闡述我國20世紀60年代成功合成結(jié)晶牛胰島素的啟示和收獲：敢于向難題挑戰(zhàn)，堅持嚴謹?shù)目茖W作風，依靠團隊間的合作，發(fā)揚奉獻的精神，為我國生命科學培養(yǎng)了一批人才，提高了我國有關(guān)領(lǐng)域的科研水平以及帶動了我國相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)。
2 敢于向難題挑戰(zhàn)
1958年在大躍進形勢的鼓舞下，我國科學家大膽提出了合成胰島素的課題。當時在國際上合成的最大多肽是促腎上腺皮質(zhì)激素的十三肽片段。此前du Vigneaud于1955年曾合成了含有一個-S-S-環(huán)的催產(chǎn)素，也只是一個九肽[4-5]。而胰島素是一個蛋白質(zhì)，不僅分子量大而且結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，分子中含有三對-S-S- 鍵。胰島素合成涉及有機合成、化學與生物分析、生物活性等方面。其工作量之大、難度之高是生物化學與有機化學領(lǐng)域中前所未有的。
在我國當時的條件下，靠一個單位來完成這個項目顯然是不可能的。1959年3月中國科學院上海生化所派了曹天欽、鈕經(jīng)義、鄒承魯、魯子賢、王芷涯等5人到北大來探討與北大共同合成胰島素的可能性，并做了有關(guān)胰島素的學術(shù)報告。北大方面積極響應(yīng)，同意承擔合成A 鏈的研究任務(wù)。
Sanger 在測定胰島素一級結(jié)構(gòu)時，先把胰島素拆分成A鏈和B鏈，經(jīng)純化后再分別測定它們的氨基酸序列。據(jù)此，我們在設(shè)計合成路線時，考慮到是否可以先分別合成A鏈和B鏈，再把A、B鏈連接成為胰島素呢？由于當時還沒有對巰基(-SH)選擇性的保護基，所以含有6個-SH基的A鏈與B鏈連接方式將有非常非常多的可能性。Kauzmann曾計算過，并在理論上指出A與B鏈不僅可以以A1B1 而且可以AnBm 各種可能的方式結(jié)合，此處n與m可以是0或任何正數(shù)。因此Kauzmann認為，A 鏈與B 鏈形成正確的胰島素結(jié)構(gòu)的可能性也就很小[6]。按照這一推論，合成胰島素幾乎是不可能的。
關(guān)于胰島素分子中三對二硫鍵如何能正確配對的問題在立項時就困擾著大家。為了解決這個問題，1959年初上海生化所鄒承魯課題組的杜雨蒼、張友尚等開始探索天然胰島素拆分與重組合的研究。他們的拆、合研究經(jīng)歷了多次失敗后，于1959年3月取得了好的苗頭，發(fā)現(xiàn)重新氧化拆開后的胰島素A、B鏈的混合物能表現(xiàn)出天然胰島素0.7%~1% 的活力。經(jīng)過進一步探索，拆分和重組合后的胰島素生物活力可以達到天然胰島素的5%~10%。他們最終發(fā)現(xiàn)，在適當條件下氧化被還原的A鏈和B鏈，生物活力的恢復(fù)可達50%。經(jīng)過多次純化，杜雨蒼等最終獲得了與天然胰島素相同的正立方體結(jié)晶。在發(fā)表論文的結(jié)論中他們明確指出“從充分芐基化了的胰島素衍生物能恢復(fù)活力這一事實，說明可以通過人工合成的A與B鏈最后合成胰島素”[7-8]。根據(jù)他們的研究結(jié)果，我們決定先分別合成A鏈和B鏈，然后用合成的A或B 鏈分別與天然的B或A鏈組合成半合成胰島素，最后用合成的A鏈與合成的B鏈完成胰島素的全合成。
總的合成路線確定后，還有一系列問題需要解決。首先，帶有保護基A鏈和B鏈的合成，因為側(cè)鏈的官能團很多，而要按指定順序連接時，必須對不讓其反應(yīng)的基團加以保護(我們戲稱之為穿靴戴帽)。有的保護基需在不同階段順利脫除，而有的保護基則要到最后才脫除。所以對于胰島素中氨基、羧基及側(cè)鏈官能團的保護基的選擇和設(shè)計是十分關(guān)鍵的步驟。其次，組成胰島素的51個氨基酸殘基中，除4個甘氨酸殘基(Gly) 外，其他47個氨基酸殘基均為手性分子，在合成反應(yīng)的每一步，包括肽鍵形成及脫保護基時，均要保證手性分子不發(fā)生消旋反應(yīng)，否則將導(dǎo)致胰島素生物活性失活。所以在設(shè)計合成路線時，何處為避免消旋的最佳接頭、合成方法的選擇以及保護基的選擇與脫除條件均為合成的難點。另外，當時大部分合成胰島素的最基本的原料氨基酸，都要靠外匯進口。為解決這一問題，上海生化所抽調(diào)了陳遠聰?shù)葎?chuàng)建了我國第一個生產(chǎn)氨基酸的東風生化試劑廠，解決合成胰島素所需氨基酸的燃眉之急[9]。
3 堅持嚴謹?shù)目茖W作風
胰島素合成是一個復(fù)雜的系統(tǒng)工程。它是由51個氨基酸通過200多步化學反應(yīng)而合成的具有生物活力的蛋白質(zhì)。合成中每一個步驟都會影響最后的成敗，因此對每一步反應(yīng)都必須嚴格把關(guān)。所有的中間產(chǎn)物均經(jīng)過嚴格鑒定合格后才能用于下一步反應(yīng)。
在合成過程中，制備的大多數(shù)肽段均使用兩種或兩種以上不同的路線或方法去得到同一性質(zhì)的產(chǎn)物，從而保證目標肽產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的正確性。例如在胰島素A鏈合成中，北大負責N-端九肽(A1-9) 的合成，由于九肽中有一個-S-S-鍵小環(huán)，結(jié)構(gòu)特殊，在合成時就設(shè)計了4+5和5+4兩條不同的路線以及不同的接肽方法，得到了分析數(shù)據(jù)相同的九肽后，才認定了我們的N-端九肽的合成正確無誤[10-11]。由于當年沒有質(zhì)譜、核磁共振等現(xiàn)代光譜分析手段，所有小肽均要通過元素分析、氨基酸的定量分析、不同溶劑系統(tǒng)的紙層析(因為那時沒有TLC薄層析板)，以及熔點、電泳、比旋光度、酶解圖譜等的測定。只要其中一項分析不過關(guān)，就不能進行下一步反應(yīng)，必須重新合成或經(jīng)反復(fù)純化后再做分析鑒定。元素分析數(shù)據(jù)的理論值雖然事先都經(jīng)過仔細的計算，但是結(jié)果出來后，汪猷先生還要親自再用計算尺(當時尚無計算器) 復(fù)審我們的計算是否有誤。
中國科學院上海生物化學研究所、上海有機化學研究所和北京大學化學系三個單位經(jīng)過通力合作，嚴格、嚴謹?shù)貙嵏?，?/span>1965年9月終于得到了全合成的牛胰島素結(jié)晶。全合成實驗重復(fù)了四次均得到了牛胰島素結(jié)晶[12-14]。
1966年11月在中科院副院長吳有訓的主持下，在上海召開了專家鑒定會。會議肯定了這一成果的創(chuàng)新性和重大學術(shù)意義。同時也提出，為了慎重，在向世界宣布這一重大成果之前，還需要補充酶解圖譜等數(shù)據(jù)。在這次鑒定會上，專家們踴躍發(fā)言，各抒己見，對取得的結(jié)果進行了實事求是的討論。當時熱烈討論的情景至今記憶猶新。根據(jù)鑒定委員的建議和意見，我們進一步補充了數(shù)據(jù)。
1966年4月由國家科委組織全國有關(guān)專家，在北京再次舉行成果鑒定的擴大會議。上海生化所和上海有機所參加胰島素合成工作的全體同事都到北京來，聽取鑒定委員們的意見。這次鑒定委員共有40多名，其中有北大的張龍翔、陳同度、沈同、唐有祺、張滂、杜錦珠、黃愛珠、陳廉生等老師。會議通過了鑒定，一致認為我們通過人工合成得到了與天然牛胰島素完全相同的結(jié)晶牛胰島素。會后中國科學院郭沫若院長接見了全體鑒定委員和參加胰島素合成的全體工作人員[15]。該項成果于1982年獲國家自然科學獎一等獎。
4 依靠團隊的合作
如前所述，胰島素合成是一個復(fù)雜的系統(tǒng)工程，涉及有機合成、化學與生物分析、生物活性等方面，工作量大、難度高。在我國當時的條件下靠一個單位來完成這個科研項目是不可能的。
1960年北京大學、復(fù)旦大學與中科院上海幾個研究所共幾百人先后開展了科研群眾運動(或稱大兵團作戰(zhàn))。北大化學系為了合成胰島素，停止了正常的教學工作。參加研究的主力是沒有經(jīng)過嚴格科學研究訓練的四、五年級大學生(那時北大理科由五年制改為六年制) 和一些年輕老師。低年級同學則負責處理溶劑、試劑制備、氨基酸提取、分離和后勤等工作。參加研究的同學們憑著一股革命熱情不分晝夜地加班加點。但是他們不了解必須經(jīng)過多種分析手段才能確定合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與純度。用未經(jīng)嚴格分析鑒定的中間體進行下一步反應(yīng)，所得到的結(jié)果是無法肯定是否為預(yù)期的目標產(chǎn)物。事實證明，各單位的大兵團作戰(zhàn)都沒有得到預(yù)期的結(jié)果。
到1960年下半年，由于國家經(jīng)濟處于極端困難時期，基于中央“調(diào)整、鞏固、充實、提高”的八字方針，各單位合成胰島素的群眾運動，在付出巨大代價后紛紛收場[15]。北大化學系只留下李崇熙、陸德培、張明哲、伍少蘭等少數(shù)幾位老師整理群眾運動留下的樣品，繼續(xù)胰島素A鏈片段的合成，后來發(fā)表了論文[16-17]。
1963年，國家經(jīng)濟形勢好轉(zhuǎn)后，在國家科委聶榮臻主任及上海市和北京市各級領(lǐng)導(dǎo)支持下，決定集中“精銳部隊”在上海重新合作，繼續(xù)開展胰島素合成的研究。為了便于及時交流和討論遇到的問題，1964年3月北大抽調(diào)了5位年輕教師在有機教研室主任邢其毅教授和副系主任文重老師率領(lǐng)下，到上海有機所參加胰島素A鏈的合成。在北大成員中有師姐季愛雪、師兄陸德培、李崇熙、施溥濤和我。后來邢先生的研究生湯卡羅也加入了我們的團隊[15]。我們與上海有機所的徐杰誠、張偉君、陳玲玲、錢瑞卿、李鴻緒和實驗輔助人員王思清、劉永福與姚月珍等密切合作重新進行牛胰島素A鏈的合成。
我們和有機所的同事在同一間實驗室工作，并定期到負責合成B鏈和A、B鏈拆合研究的上海生化所匯報工作進展及討論遇到的問題，及時調(diào)整工作計劃和人力安排。通過三個單位的協(xié)作，大大提高了工作效率。
胰島素中的A鏈雖然比B鏈短，但是A鏈的合成并不順利。最初在半合成胰島素時，我們合成的A鏈與天然胰島素B鏈組合后，所得產(chǎn)物的生物活力只達天然胰島素的1%~4%。經(jīng)過大家反復(fù)討論，認為很可能是A10-21 后十二肽酯在皂化脫保護基時的副反應(yīng)所致。為了避免后十二肽酯的皂化，重新設(shè)計保護基策略，將17位谷氨酸的γ-羧基由甲酯改為叔丁酯，而C 末端的天冬酰胺的α-羧基則不加保護。同時決定分別用3+9與7+5兩條不同的路線合成。由于保護基策略的改變，整個后十二肽(A10-21) 需要推倒重來，工作量非常大。那時B鏈已合成出一定量，在等待著A鏈的合成。為了加速新設(shè)計的后十二肽的合成，北大的李崇熙老師被調(diào)到后十二肽組，與有機所同事共同完成了新十二肽的合成[18]。用這個新設(shè)計的后十二肽(A10-21)
與N-端九肽(A1-9) 合成的A鏈[19] 經(jīng)鈉-氨法除去所有保護基得到A-SSO3- 經(jīng)進一步純化后，與天然胰島素B鏈組合后，所得半合成產(chǎn)物的生物活力提高到天然胰島素的5%~10%。最后，經(jīng)過反復(fù)探索半合成粗產(chǎn)物的純化方法后，終于獲得了形狀與天然胰島素相同的結(jié)晶。在紙層析與紙電泳譜上與天然胰島素處于同一位置。小白鼠驚厥法測定表明，所得半合成產(chǎn)物具有與天然牛胰島素同等的生物活力。這表明了半合成的成功[20-21]。
人工合成胰島素雖然是50年前的事，但是許多情景至今還歷歷在目。印象最深的是合成A鏈時，北大派陸德培為代表，有機所派徐杰誠為代表進行實驗操作。汪猷先生親臨現(xiàn)場，其他人在陸、徐二人周圍觀看。玻璃滴管頭拉得很細，以便精細調(diào)節(jié)溶液的pH值。再根據(jù)精細pH試紙的顏色，現(xiàn)場討論是否要再多加一滴堿或一滴酸。可惜當時沒有相機，沒能拍下這一難忘的認真、緊張和激動人心的合作場面。最后胰島素的半合成與全合成是在生化所進行的。施溥濤代表北大，張偉君代表有機所與生化所杜雨蒼等少數(shù)人進行實驗，其他人只能在實驗室外面等待結(jié)果。
事實證明依靠精銳團隊間的合作是一條成功之道。
5 發(fā)揚奉獻的精神
當時德國的H.Zahn和美國的P.G.Katsoyannis都已經(jīng)開始了胰島素的合成研究, 并發(fā)表了關(guān)于胰島素片段合成的簡報。到1963年年底，Katsoyannis和Zahn還分別宣稱他們合成了胰島素。不過他們始終未能獲得合成胰島素的結(jié)晶。他們所合成的胰島素也只具有微弱的生物活力。盡管如此，他們?nèi)〉玫某晒o了我們巨大的壓力。
當年參加該項研究任務(wù)的大多數(shù)是年輕人，熱情非常高，決心要趕在德國人和美國人之前完成胰島素的合成。大家深知責任重大，必須全身心地投入工作。1964年初，季愛雪、李崇熙和我都有一個一歲上下的孩子需要人照顧。為了工作需要，我們克服個人困難，離開自己的家人到上海工作。
在合成的過程中大家不分主角和配角，配合默契。比如，在A鏈合成工作中，我們根據(jù)工作需要，分擔了為公共服務(wù)的工作。由于市售的溶劑純度不夠或含水量較大，我們每人包干一、二種溶劑的處理來供大家使用。在試劑的合成方面，我們常用的氨基酸的氨基保護劑是由毒性較大的光氣制備的。脫保護基的溴化氫-冰乙酸及保護谷氨酸的γ-羧基的叔丁酯等均需要自己制備后提供給大家使用。
為了爭取早日合成A鏈，我們沒有周末，沒有節(jié)假日，整天泡在實驗室做實驗或到圖書室查閱文獻。當時沒有獎金和加班費，誰都沒計較。我們北大幾人的月工資分別為62元或56元，在北大工作時沒有保健費，但是在上海有機所，每月有了3元多的保健費，大家就很滿足了。另外，在北京每人每月只有2斤大米的供應(yīng)，我是南方人，在上海不必吃窩窩頭等雜糧，每天能吃米飯就感到非常高興。盡管我們和家人分離，生活非常單調(diào)，但認識到是在進行一項為國爭光的重要任務(wù)，也就不顧及個人得失了。
從胰島素課題的提出到進行胰島素拆合與全合成整個過程中，有幾位老科學家，比如時任上海生物化學所所長的王應(yīng)睞、副所長曹天欽和沈昭文先生等，自始至終給予了我們大力的支持和幫助，在關(guān)鍵時刻為我們出主意。然而在最后發(fā)表的文章里卻沒有留下他們的名字。還有一些參加過工作的如張友尚先生等，也沒有計較文章發(fā)表時沒有列出他們的名字。他們的高風亮節(jié)讓我們敬佩和感動，是我們學習的榜樣。
當全合成一文在《中國科學》上發(fā)表時，沒有人去計較作者的排列次序。北大化學系副系主任文重老師建議根據(jù)大學畢業(yè)年限依次排列，即最早畢業(yè)的排在前面，畢業(yè)晚的排在后面。大家都沒有提出異議。
1965年在《中國科學》雜志上發(fā)表的全合成的文章上署名共21 人[12-13]。事實上，北大化學系、上海有機所和上海生化所三個合作單位里在前期涉及該項研究的少說也有上百人。有些同事曾參加過一些胰島素A鏈或B鏈中片段的合成，并發(fā)表了文章，為后來的研究提供了經(jīng)驗。但是最后的文章上卻沒有他們的名字，他們是功不可沒的無名英雄。
6 培養(yǎng)了一批人才
參加胰島素合成的人員在整個研究過程中，受到完整和嚴格的培養(yǎng)和訓練。他們就像種子一樣，以后培育了一批又一批的學生和后來人。這些人才在各自選定的方向上，開展對多肽與蛋白質(zhì)的各種研究。
從20世紀80年代到90年代，參加胰島素工作中的大多數(shù)人成為多肽和蛋白質(zhì)領(lǐng)域研究的學術(shù)
帶頭人。其中一些教授被評選為中國科學院院士。
為了發(fā)展我國的多肽研究和加強學術(shù)交流，特別是為了了解國際上的進展與動態(tài)，參加合成胰島素的三個單位均組織過中國國際多肽學術(shù)會議。1990年由上海生化所杜雨蒼教授牽頭并籌措經(jīng)費，在上海舉辦了第1屆中國國際多肽學術(shù)會。會議邀請了國外幾位著名多肽科學家參加并做學術(shù)報告，使中國學者開闊了眼界。在那次會議結(jié)束的晚宴上，鈕經(jīng)義教授等為紀念人工合成胰島素25周年做了精彩的發(fā)言。
從此，中國國際多肽學術(shù)會，每隔兩年舉辦一屆。杜雨蒼教授共主辦過三屆(1990年、1992年與2002年)。我本人與時任北京大學化學學院院長徐筱杰教授于1996年主辦了第4屆會議[22]。上海有機所徐杰誠教授與徐紅巖博士于2000年主辦了第6屆會議。從第7屆會議到去年第13屆會議，均由年輕一代教授主辦，每次會議都有十幾個國家與地區(qū)的多肽科學家參加。歷屆會議，無論是口頭報告還是墻報的內(nèi)容，都顯示了我國多肽研究水平不斷提高，其中有些工作達到同類工作的國際水平。同時，我國多肽研究的隊伍也在不斷擴大。許多年輕人加入到了這個領(lǐng)域來并做出了高水平的研究成果，我們?yōu)樗麄兏吲d和驕傲。
改革開放后，作為學術(shù)帶頭人，我有機會參加了國外相關(guān)的學術(shù)會議，諸如規(guī)模最大的美國多肽會議(APS)、歐洲多肽會議(EPS) 與日本多肽會議(JPS)、澳大利亞多肽會議(AuPS)、亞太地區(qū)多肽會議及國際多肽會議等。我們不僅從中學到了新思想、新方法，同時也結(jié)交了一大批國際同行朋友。
此外，許多年輕人在國外取得博士學位或有了博士后的研究經(jīng)驗后，回國從事多肽或蛋白質(zhì)方面的研究工作?，F(xiàn)在中國多肽事業(yè)后繼有人，令人欣慰。
7 提高了科學研究的水平
胰島素合成成功后，由中國科學院物理所、生物物理所和北京大學有關(guān)人員組成了胰島素晶體結(jié)構(gòu)研究組。在文化大革命那個非常時期立題、上馬，先后以4 ? (1970年)、2.5 ? (1971年) 和1.8 ? (1973年)的分辨率測定了豬胰島素三方二鋅晶體結(jié)構(gòu)。這是繼合成胰島素之后我國蛋白質(zhì)科學研究的又一重要成果[23]。該項成果于1982年獲國家自然科學獎二等獎。
成功合成胰島素不僅促進了蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的研究，還促進了化學與生命科學研究相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展。比如，胰島素結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究，生物活性肽與蛋白質(zhì)的分離、純化與結(jié)構(gòu)鑒定，生物活性肽的合成及合成方法學的研究，生物活性肽結(jié)構(gòu)與功能的研究，以及多肽與蛋白質(zhì)毒素的研究等。
就個人來說，參加胰島素合成對我影響最深的有兩點：一是選題要有創(chuàng)新性、敢于向難題挑戰(zhàn)，二是科學研究必須持嚴謹?shù)膽B(tài)度。
文化大革命后，我們在有機教研室主任邢其毅教授領(lǐng)導(dǎo)下，開展了多肽合成方法學的研究[24-28]，并于1988獲國家教委科技進步獎二等獎。邢先生常說科研的創(chuàng)造性就是要有“想頭”，要做別人想不到的課題，用現(xiàn)在的話說就是要有創(chuàng)新思維。
1986~1995年期間，邢先生先后主持國家自然科學基金七五重大項目“我國獨特的及豐產(chǎn)的天然產(chǎn)物研究”與八五重點項目“我國邊遠地區(qū)和海洋獨特天然產(chǎn)物的研究”兩大課題的研究，有10余所大學和研究所參加。我們承擔的子課題是“參類水溶性化學成分的研究”。研究名貴中草藥人參水溶性成分中的寡肽和非蛋白氨基酸。過去對于中草藥的研究主要利用極性不同的有機溶劑提取其化學成分，而服用中草藥卻以水煎法為主。以前對于人參化學成分的研究主要集中于皂苷成分的研究，而有關(guān)其中的肽類化合物卻幾乎沒有涉及。分離和純化水溶液中的寡肽有很大的困難。當時我們化學系僅有一臺分析型的高效液相色譜儀，不能用于人參水提取液的制備分離。我們克服了重重困難，最終首次從人參中分離純化了一些具有生物活性的寡肽和非編碼氨基酸。該項成果獲得了1995年國家教委科技進步獎一等獎。
在指導(dǎo)研究生的工作中，我們特別注意傳承老一代科學家對科學研究嚴謹求實的學風。例如從人參水提取液中分離純化了一個氧化型谷胱甘肽的異構(gòu)體時，我們發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)就是甘氨酸和胱氨酸調(diào)換了位置，即C-端不是甘氨酸而是胱氨酸。邢先生認為1929年發(fā)現(xiàn)的谷胱甘肽到現(xiàn)在有60多年了，要確認一下這期間是否已有人發(fā)現(xiàn)了這個異構(gòu)體。我和幾位博士生、博士后反復(fù)查閱文獻，的確未見文獻報道。后來又用化學法合成這個異構(gòu)體再與從人參水提取物對照，確認結(jié)構(gòu)無誤后才發(fā)表了這個研究結(jié)果[29-30]。1987年，我在為研究生開設(shè)“生物有機化學”這門新選修課時，看到一篇文獻報道豬胰脂肪酶在有機溶劑中以及高溫下仍保持活性，并能在有機溶劑中進行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。這篇文章引起我極大的興趣。蛋白水解酶是水解肽鍵的，可否在有機溶劑中用蛋白水解酶形成肽鍵？可否用分子篩固定蛋白水解酶在有機溶劑中進行肽的合成反應(yīng)？經(jīng)由研究生查閱文獻，結(jié)果沒有找到相關(guān)的報道，我認為是好事，可以由此開拓創(chuàng)新的研究空間。經(jīng)過十多年的研究，我們終于在不同的有機溶劑中，成功地用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜酶、枯草桿菌蛋白酶等合成了一系列生物活性肽，并研究了各種因素對合成的影響。為了擴大蛋白水解酶的應(yīng)用范圍，改變酶催化反應(yīng)的底物過于專一的限制，我們用非編碼氨基酸，D-氨基酸，甚至結(jié)構(gòu)與氨基酸完全不同的甾體化合物作為底物，在有機溶劑中，用蛋白水解酶催化酰胺鍵的形成，最后得到了預(yù)期的目標化合物[31-32]。我們還探索將不同的蛋白水解酶固定在不同結(jié)構(gòu)的分子篩上合成了一些小肽，在一定條件下固定化酶可以重復(fù)使用，延長了酶的壽命。此外，還研究了各種因素對固定化酶催化的影響。我們的研究結(jié)果在Tetrahedron(四面體) 雜志發(fā)表后[33]，應(yīng)美國Applied Biochemistry and Biotechnology雜志主編之邀，撰寫了一篇有關(guān)分子篩固定化酶的綜述[34]。
通過參加胰島素的研究，使我深刻認識到對待科學研究必須堅持嚴肅、嚴格和嚴謹?shù)目茖W作風。在研究有機溶劑中用蛋白水解酶合成生物活性肽時，我們常設(shè)計兩條不同的合成路線，或用兩種不同的蛋白水解酶合成同一個目標肽，并用化學法合成對照酶法的合成產(chǎn)物，以確認目標產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的正確性。在指導(dǎo)學生作研究的過程中，有時學生認為老師過于認真，要求太苛刻，心中產(chǎn)生不悅。但是當他們工作后，就非常感激老師曾對他們的嚴格要求。有些學生現(xiàn)在也當了老師，他們在研究中繼續(xù)傳承嚴格和嚴謹?shù)目茖W學風，使我感到十分高興。
8 帶動了相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)
胰島素合成有力地推動了我國多肽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。在合成胰島素前，國內(nèi)的多肽研究可以說是一個空白。人工合成胰島素課題開始時，國內(nèi)買不到合成胰島素需要的氨基酸，生化所于1958 年在國內(nèi)首次創(chuàng)建了東風生化試劑廠生產(chǎn)氨基酸，解決了合成胰島素的原料問題。后來該廠擴大了生產(chǎn)品種，除氨基酸外，還生產(chǎn)其他的生化試劑，成為國內(nèi)提供多種生化試劑的生產(chǎn)基地。
除東風生化試劑廠外，胰島素合成也帶動了我國整個生化產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，包括氨基酸、生物活性肽、多肽藥物、胰島素等蛋白質(zhì)激素及生化試劑的生產(chǎn)。目前國內(nèi)有幾十家生產(chǎn)氨基酸和生化試劑的公司。它們不僅生產(chǎn)氨基酸，還生產(chǎn)各種不同保護基的保護氨基酸、縮合試劑、生物活性肽及各種生化試劑，還有用于固相合成肽所需要的不同結(jié)構(gòu)、不同型號的樹脂。這些產(chǎn)品無論從品種上，還是從質(zhì)量上來講，均與國外品種相當。許多我國生產(chǎn)的氨基酸出口國際市場，其中不少產(chǎn)品已登在國際知名公司Sigma 和Aldrich 的目錄上。
現(xiàn)在，我國不少多肽公司或制藥公司均有GMP (Good Manufacturing Practice 的縮寫) 車間。它們生產(chǎn)的肽類藥物如催產(chǎn)素、LHRH等均獲得中國藥監(jiān)局批準，已在臨床使用。目前各大醫(yī)院臨床所用的胸腺五肽、胸腺α1 (二十八肽) 等肽類藥物均可由我國多家公司提供。這些產(chǎn)品不僅質(zhì)量有保證，而且價格比進口的要便宜得多，經(jīng)濟上易為一般患者所接受。目前在臨床上應(yīng)用的胰島素大部分已用人胰島素代替了過去常用的動物胰島素如豬胰島素、牛胰島素等，重組人胰島素的問世才可能為糖尿病患者提供人胰島素。據(jù)報道，我國現(xiàn)在已成功研制、開發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因重組人胰島素，改變了長期以來依賴進口的局面[35]。
9 結(jié)束語
人工合成結(jié)晶牛胰島素是世界上第一個合成的蛋白質(zhì)，是人類在探索生命奧秘的征途中向前邁進的一大步。從學術(shù)理論和方法學上講，我們的成功有力地證明了蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定其高級結(jié)構(gòu)的科學論斷。這是蛋白質(zhì)合成和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究中的重大發(fā)現(xiàn)，從而也否定了Kauzmann計算胰島素中-S-S-鍵正確配對的幾率極小的推論。人工合成結(jié)晶牛胰島素的成功是我國在基礎(chǔ)理論研究中取得的重大成就，在國際上顯示了我國科學家的智慧和能力。有機化學家認為，合成固體有機化合物是否獲得結(jié)晶往往是化合物純凈的金指標。Zahn 與Katsoyannis僅得到具有微弱生物活力的產(chǎn)物, 始終未得到合成的胰島素結(jié)晶。1965年《中國科學》雜志上發(fā)表了全合成結(jié)晶牛胰島素簡報后，德國Zahn教授很快來信祝賀我國“第一次完成了結(jié)晶牛胰島素的半合成與第一次完成了結(jié)晶牛胰島素的全合成”。他還多次對我國有關(guān)科學家說，是中國取得了這場國際競賽的勝利[15]。1966年4月，王應(yīng)睞、鄒承魯和龔岳亭參加了在波蘭華沙舉行的歐洲生化學會聯(lián)合會，龔岳亭向大會宣讀了中國科學家取得的這項成果后, 美、英、法、意、荷、比等國科學家紛紛祝賀我們?nèi)〉玫膫ゴ蟪晒?。美國?/span>Science 雜志評論我國胰島素的全合成的成就是在蛋白質(zhì)合成領(lǐng)域中由量到質(zhì)的轉(zhuǎn)變[36]?！?/span>The World ofPeptides》一書也提到中國合成的胰島素得到了結(jié)晶[37]。
受益于參加胰島素的合成，我們在多肽領(lǐng)域里的研究成果曾應(yīng)邀到日本、韓國、美國、法國、奧地利、澳大利亞等國的大學、研究所或?qū)W術(shù)會議上報告。
我國成功合成結(jié)晶牛胰島素依靠的是敢于向難題挑戰(zhàn)的自信和勇氣、嚴謹?shù)目茖W作風、幾個兄弟單位間的精誠合作和參與個人的無私奉獻的精神。它為我國生命科學培養(yǎng)了一批人才，為有關(guān)產(chǎn)品提供了研發(fā)的鍥機，為發(fā)展我國生命科學研究奠定了基礎(chǔ)。
（本文原發(fā)表于《生命科學》2015年第27卷第6期）